(no subject)

[aridmoors]

Хотите мы с вами "разработаем тест на коронавирус" прям щас?



На самом деле те, кто занимается исследованиями коронавируса, понимают, что все немного сложнее, но я тут опишу базовую последовательность, шоб так сказать дать пример.

Дак вот. Во-первых, сразу скажу, что меня корежит от словосочетаний "разработали тест" или "закупили столько-то тестов", потому что это жутчайшее искажение реальности. В мире, полном ДНК-последовательностей, накосячить последовательность и прогнать ее - это не может обзываться гигантским словосочетанием "РАЗРАБОТАЛИ ТЕСТ" или "ПРОДАЛИ ТЕСТ". Продали ЧТО? Последовательность ДНК? Она в открытом, лять, доступе в интернете лежит.

И потому что вообще-то подгонкой праймеров и тестированием их занимается чуть ли не каждая вторая био-лаба в мире. Это стандартная процедура, в которой нет никаких тайн.

Итак, "разработаем тест".

Для этой самой, прости господи, разработки нам нужна последовательность вируса. Она лежит в интернете в открытом доступе гигантскими количествами.

Например, взять статью:
https://mra.asm.org/content/9/11/e00169-20

Из нее уже дофига линков ведут на конкретные последовательности. Берем любую, например самую первую, Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate 2019-nCoV WHU01, complete genome
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN988668)
Можете прям идти по линкам, они все рабочие.





Как вы могли заметить, справа вверху там есть список, в котором есть "pick primers". Жмем туда.
Вылетит следющий скрин:





В этом скрине вы видите, что у нас уже высталвена последовательность (Enter accession, gi, or FASTA sequence (A refseq record is preferred): MN988668.1), нам надо только выставить параметры.

Выставляем стандартные (убираем из поля "organism" номер, который там, и нажимаем кнопочку внизу Get Primers). Получаем результат (иногда надо подождать, если сервер у них перегружен):



Итого: вам нагенерилось дофига праймеров (последовательностей TGAGCCAGTGCTCAAAGGAG).

Всё.
Вы типа "разработали тест". Урааааа, сколько работы!!!!

Дальше надо попробовать пронать эти праймеры на конкретном вирусе (а вот разрешение на работу с ним, или его образцами, может быть ДАЛЕКО НЕ В КАЖДОЙ лабе) - но когда вы прогоните, можете смело заявлять, "я разработал тест!"

Хотя по сути вы три минуты посидели в интернете, ога.

Нет, я серьезно, процедура "разработки теста" вот именно примерно так и выглядит. Понятно что надо потом проверить, насколько хороши праймеры, однако судя по современной ситуации, они все где-то вот так и делались. То есть "посидел 3 минуты в интернете".

Так. Дисклеймер. Это я не для дискредитации труда биологов говорю, я сама биолог. Я для того, чтобы вы понимали, что такое "разработка теста", и почему не надо смотреть на словосочетание "разработали тест" восторженными глазами. Не надо. Потому что нифига там не надо "разрабатывать". Там 3 минуты посидеть в интернете, а потом надо ручками-ручками, проверять-проверять-проверять". Чего делалось или не делалось - неизвестно в каждом конкретном случае.

Comments

[alexanderr.livejournal.com]

мне хотелось бы провериться не на вирус, а на антитела.
такой тест легко сделать? быстро? хотелось бы поскорее.

если у человека официально есть антитела, а вируса нет,
то он сразу освобождается от карантина.

[aridmoors.livejournal.com]

Не знаю где такой щас можно сделать.

[white-unihorn.livejournal.com]

вот да.

[experiment8or.livejournal.com]

почему ковид ПЦР так хреново работоает в разных руках и на разных приборах в клинике? Реактивы? Среда? Инстpументы? Почему?

[aridmoors.livejournal.com]

Скорее всего именно праймеры, хотя я никогда не собирала (и думаю нито не собирал) статистику как именно работает ПЦР в разных РУКАХ.

[experiment8or.livejournal.com]

если праймеры одни и те же, то за счет чего такая разница? Клинические лабороатории, там все на это заточено.

[aridmoors.livejournal.com]

Дак за счет праймеров же. Если праймеры разные дак и результат будет разный.

[experiment8or.livejournal.com]

вопрос от чайника: а разве нет консенсуса, какие праймеры использовать? СДС с парймерами облажалось, но сейчас то должен быть консенсус, уникальные последовательности, где лучше результат например?

скорее выздоравливайте!

[nenastja.livejournal.com]

У нас собирали, но не по новому вирусу, а по гриппу, в прошлом году. Разослали по лабораториям образцы, которые надо было определить. По результатам немало людей со всей страны отправились на курсы повышения квалификации...

[aridmoors.livejournal.com]

У вас еще курсы есть...

[nenastja.livejournal.com]

Я точно знаю, что в России есть лаборатории, в которых ПЦР делают плохо, и причина - кривые руки, недостаточные знания.

[experiment8or.livejournal.com]

я в штатaх, это клинические лаборатории

[jetstalker.livejournal.com]

Вы так уверены, что в клинических лабораториях штатов нет кривых рук?
Ну и если материал для анализов берется путем мазка, то это по определению лотерея.

[agapova.livejournal.com]

False negatives may also be a matter of timing. “There’s a misconception if a person has COVID, the virus is all over the place,” Tran said. “That’s not true.” It mostly concentrates in the lungs, which is why some doctors have advocated for chest CT scans or lower respiratory tract specimens as means of testing. It doesn’t appear in the blood, though eventually people who survive the disease begin to produce antibodies to the virus that can be detected in a blood sample. And though COVID-19 can be found in the nasopharynx and even the nasal cavity itself, the concentration of the virus varies over time. Right now, the test appears to be most effective in patients who have been showing symptoms (specifically a fever and cough) for three to five days, said Omai Garner, an assistant professor of pathology and laboratory medicine at UCLA. No one knows how well it detects the virus in people who are asymptomatic, or how reliable it is after a patient has begun to recover.

[haladdin.livejournal.com]

Мне тут от скольково пришло на почту. Они уже два миллиона собрали.

[aridmoors.livejournal.com]

Охренеть. Чем я занимаюсь?! Штаны просиживаю. Бабло рубить надо, вон как люди делают!

[haladdin.livejournal.com]

=))
Сама ссылка там написано как они это собираются реализовать https://boomstarter.ru/projects/zhimbiev/razrabotka_ekspress-testa_na_koronavirus?fbclid=IwAR3pdkKwLCUOZNgPb1ZXIDrdiSQ5EQhg_6nqXYoC6h1oC8MzfPuillHAUTQ

Интересно ваше мнение. =)
Но в целом да, деньги то они уже собрали. Потом можно сказать "ну нипалучилась". Как один небезызвестный блоггер собирал деньги на постройку лунохода (!) чтобы запустить его к местам посадки апполонов. Не помню сколько они собрали, но тоже в миллионах сумма. Надо ли говорить что ни лунохода ни миниспутника вообще нихуа не сделано. Зато донаторы получили трехкопеечные фанерные значки. =)

[misha-makferson.livejournal.com]

Вообще-то человек сразу честно предупреждал, что заявленной к сбору суммы хватит только на аванпроект. Чтобы сделать лунный спутник в металле и запустить его такие деньги собрать вообще нереально (по крайней мере в России). Аванпроект они сделали.

[aridmoors.livejournal.com]

Я в любом слуае хочу как они)))

[alexbreeze.livejournal.com]

Я правильно понял что вы дали набор азотистых оснований? Но ведь тест или вакцина нужны в реале . И значит те основания надо сначала собрать в молекулу именно в такой последовательности(кстати как это интересно делается в реале?) , потом масштабировать и конечно проверить на практике. И сколько в реале есть предприятий способные на такую работу в кратчайшие сроки?

[russian-o.livejournal.com]

В реале это делает автомат, куда загружают последовательность и моно-нуклеотиды. Компаний таких сотни, стоит это копейки. Делается за несколько часов.

[alexbreeze.livejournal.com]

тогда что ж не делают в пром.объемах? раз все просто и за копейки?

[russian-o.livejournal.com]

Делают, почему нет? Там узкое место это персонал, машины для пцр, протокол теста и подготовка образцов.

[p2004r.livejournal.com]

Судя по всему "с улицы зайдя" никаких primers не купишь?

[russian-o.livejournal.com]

Да запросто. Заказываешь через интернет, присылают почтой. Только зачем они вам?

[p2004r.livejournal.com]

А вам зачем?

[russian-o.livejournal.com]

Были бы нужны на коронавирус, заказал бы. Но пока не надо, и вряд-ли понадобится. А по моей работе у меня их около тысячи разных хранится. Заказ праймеров - рутина, занимающая минуты.

[p2004r.livejournal.com]

Ну вот например заказать на хеликобактер пилари праймер, что бы в микробиоме случайных 200 человек в популяции поискать, сколько обойдется? Или это вообще не проханже?

PS

Пусть сам пцр аппарат будет из говна и палок самодельным. И это не рокетсайенс в виде "Секвенирование ДНК в домашних условиях: как на коленке собрать прибор за 10 миллионов", пусть будет простой амплифер в стиле "Arduino PCR (thermal Cycler) for Under $85"

[russian-o.livejournal.com]

Праймер(ы) обойдуться долларов в 20-30, реагенты для ПЦР дороже, но их хватает надолго. Или можно купить набор - реакций меньше, но общая цена ниже. Скажем, баксов в 300 можно уложиться. Потом, для электрофореза почти все можно сделать на коленке, рактивы кое-какие нужны, однако. Ну еще сотни две. Обязательно нужна хоть простенькая центрифуга, пластик всякий, автоматические пипетки (можно купить б.у. недорого). Трансиллюминатор можно самому смастерить какой-никакой. Короче, в тысячу - полторы наврное можно уложиться.

[p2004r.livejournal.com]

Спасибо!

[snyders.livejournal.com]

Вижу, что в Европе народ предпочитает покупать киты, вероятно потому, что они откалиброваны, плюс наверно ватные палочки должны быть определенной длинны и не ломаться в носу. Т.е. тест на коленке собрать можно, но если надо делать тысячи тестов, нужны стандартные киты. Соответственно, если киты нужны всем, в количестве миллионов штук, то производители не справляются и даже такие страны как Швейцария сильно ограничивают критерии тестирования. Правильно?

Или, скажем, не весь процесс автоматизирован и слишком много ручной работы? Или патенты фирмы Роше? Где bottleneck?

[nicolas83.livejournal.com]

Аукционы лаб.оборудования. Можно за 5-10% от обычной цены купить.

https://www.labx.com/product/bio-rad-mycycler

[p2004r.livejournal.com]

ха, то что в каталоге 300-400 евро на 200 реакций

то чего нет в каталоге дороже?

ну вот взять какой то там GSTM1 человеческий и если загорелось его померить, а в каталоге его нет и надо заказать?

ЗЫ хотя вот небольшими порциями с открытым софтом и хардвером есть https://www.chaibio.com/sahara-hot-start-pcr-master-mix 56$

[chertenka-13.livejournal.com]

спасибо, что рассказываете. поправляйтесь!

[russian-o.livejournal.com]

Вы пропустили важную часть - проверку на кроссреакцию с другими вирусами. Тоже быстро, но всё же...

[l-b-r.livejournal.com]

Это... это же готовое задание для лабораторной работы по биологии!!!

[elotar.livejournal.com]

!

Как построить иммуноанализ - не сложнее нисколько.

[aqqua.livejournal.com]

Как построить иммуноанализ - не сложнее нисколько.

Есть две вещи, на которые нужно проверять: на сам вирус, и на антитела против оного. Антитела в крови зараженного появляются не сразу, понятно. Вначале IgM (через несколько дней). Потом IgG, так через неделю-две. Реагентов нужно немного, и все они есть в наличии; кроме одного, все были в наличии многие годы назад. Так вот. Берётся антиген - белок поверхности коронавируса. Он уже есть в продаже, рекомбинантный. Сто микрограмм стоит $200-500 (зависит от того, где и какой брать - гугл подскажет). По сто нанограмм в лунку 96-луночной стандартной плашки. И на ночь в холодную комнату, в мешок с водой, чтоб не засохло. Значит с одной упаковки можно 1000 лунок заполнить. Потом промываем. обычной водопроводной водой. Наливаем на час раствор альбумина, 1 мг/мл. Опять моем, несколько раз. Плашка готова.
Добавляем в лунки сыворотку от больных (или даже здоровых). Ждём час. Опять промываем плашку, несколько раз. Антитела свяжутся с плашкой. Теперь добавляем антитела против человеческих иммуноглобулинов (таких всегда было в наличии разных полно, хоть козьих, хоть кроличьих). Если хочется как побыстрее, то нужно к ним заранее пришить пероксидазу. Технология пришивки - совсем прошлый век, когда ПЦР был никак неизвестен. Подержали. Отмыли ещё раз. Добавили субстрат пероксидазы: это бензидин, дианизидин, или что-то аналогичное (ну и перекиси немного). И ждём, смотрим, где побуреет. Если хочется количественно, то ридер из прошлого века читает плашку за 12 секунд. В качестве стандартов - человеческие иммуноглобулины, IgG/IgM, которые нужно нанести на плашку вместо антигена. Вот и всё.

Re: Как построить иммуноанализ - не сложнее нисколько.

[aridmoors.livejournal.com]

Ну вы ЭЛИЗу же описываете?

Re: Как построить иммуноанализ - не сложнее нисколько.

[aqqua.livejournal.com]

ну конечно; я к тому, что если было бы желание, всё это можно состряпать за пару дней. Помнится, рассказывал знакомый, что в восьмидесятых, когда вирус иммунодефицита ещё только начинался, была отправлена в Африку небольшая группа из отечества, вот примерно с таким тестом. Только тогда рекомбинантных белков помногу не делали, и купить их было негде, поэтому синтезировали для посадки на плашку пептиды из белков с поверхности вируса. То ли в Уганде, то ли в Кении. Так что прошлый век.
Выздоравливайте!

[meloco-go.livejournal.com]

Как вы?