(no subject)

[aridmoors]

Сил вообще нет. Надо делать кучу экспериментов, включая сегодня - не смогла доделать, завтра надо будет идти доделывать. Сегодня тоже наблюдала, как Дзюнко делает тот же самый эксперимент, что и я, и поняла, что я совсем не так делаю вещи, как остальные. Может быть это плохо, может быть хорошо, я еще не определилась. Когда-то, когда я была студентом, я пробовала разные способы выполнения задачи "биологический эксперимент". Можно делать как? Есть два способа.

1. Прочитать все мануалы и делать все мееееедленно, прямо по мануалу, как написано. Сделать один раз и получить один результат.
2. Делать тупо КАК МОЖНО БОЛЬШЕ. Вот просто тупо делаешь как можно больше раз, делаешь как можно больше вариаций, просто тупо ДЕЛАЕШЬ БОЛЬШЕ.

Щас объясню разницу. Например, мы делаем скажем, АТФ-эссе. Это такой эксперимент, когда насыпаешь клетки в тарелку с 96 колодцами. Потом, там, в каждый колодец насыпаешь разное количество химиката, ждешь 1 день, потом применяешь в каждый колодец АФТ-реагент, и идешь измерять на машине сколько клеток подохло. Все это на слух выглядит очень прикольно и все такое, но тут начинаются нюансы. Например, клетки могут расти с разной скоростью в зависимости от того, сколько ты их насыпал. Поэтому допустим ты насыпал одно количество - получил результат, насыпал другое - получил другой. Потом, нюансы могут быть в том, что у тебя получаемые цифры будут зависеть от количества медицма, от количества АТФ-реагента, от чего угодно. В том числе если высокие концентрации вещества, допустим, результаты тоже могут давать более высокую цифру за счет отражения от стенок колодца и т.п. Много нюансов.

И вот Дзюнко делает как? Она делает все медленно и по мануалу. А я делаю все очень быстро, но зато делаю много ошибок. В результате моих ошибок мне становится интуитивно известно очень много вещей. Например, я уже знаю, что будет влиять на результат, а что нет. Я знаю, например, что полученные измерения будут больше всего зависеть вовсе не от количества клеток (как ни парадоксально), а от того сколько АТФ-реагента налить. Разница в 10 микролитров - уже хз какую разницу в цифрах даст. Соответственно, если ты ошибся на 10 микролитров - можешь сказать до свидания нормальным результатам. От количества медиума охрененно зависит. Поэтому если у тебя мульти-пипетка, которая хреново функционирует по краям, скажем (плохо насасывает), и ошибается там на те же 10 микролитров, у тебя погрешность вылетит за всякие рамки и ничем не пофиксишь.

Но! Но. Когда у меня накапливается массив всех этих знаний, я начинаю знать, как сделать по _своему_ протоколу, чтобы минимизировать погрешность.

Поэтому сегодня была очень странная картина. АТФ-реагент делается из добавления одной жидкости к порошку. Я по опыту знаю, что КАК ты смешиваешь эти вещи - абсолютно фиолетово, поэтому я тупо открываю один бутылек (с жидкостью), открываю другой (с порошком) да и наливаю жидкость в порошок. А слева от меня сидит Дзюнко и делают эту процедуру, знаете, когда берешь шприц, набираешь в него жидкость, протыкаешь эту резиновую крышечку и мееедленно вводишь жидкость с помощью шприца. У нее на это уходит час, у меня на все про все 5 минут. Зато я гораздо больше обращаю внимание на те вещи, которые важны: что надо следить за этой долбаной мульти-пипеткой, что надо следить чтобы все клетки растворились, что надо посдувать все пузыри, которые образуются (потому что иначе они работают как линза и корявят результаты потом) и т.д.

Я так и не знаю, хорошо ли это или плохо. Я могу сказать только, что я не в состоянии (у меня моя дурацкая совесть не позволяет) работать с системой и не понимать, как она работает.Я должна знать, чо за машина, чо она меряет, как она меряет, откуда она считывает, что именно считывает, какова погрешность, что больше всего влияет на систему, где провести срешхолд и так далее... А Дзюнко на белом глазу может делать по мануалу, тратить тучу времени, получить для каждой дозы реагента 2 (прописью: ДВЕ) цифры, УСРЕДНИТЬ их, и выдать за результат. При этом когда я ее прошу показать сырые данные, это пипец, у меня уши в трубочку сворачиваются. Она усредняет цифры с ТАКОЙ погрешностью, что мне страшно. Волосы дыбом. Получила две цифры, которые говорят об АБСОЛЮТНО разном результате, взяла усреднила и успокоилась...

Я так просто не могу. Если я вижу цифры, мне надо чтоб машина мне их выдавала всегда, постоянно, идеально. Я не могу когда у меня два одинаковых образца, один намерялся как 250,000, а второй как 350,000 (при том что соседний образец в котором в два раза меньше клеток намерялся как 150,000!) - я просто не могу усреднять такие цифры в здравом уме.

Это наверное горе от ума. Вот Дзюнко живет и не парится. Делает себе хрень какую-то 1 раз, не повторяет, ну все же по мануалу сделано... блин. Не знаю. У меня явно перфекционизм. Всем же насрать. Надо тупо взять и забить. Не искать истину. Не делать как надо. Все равно никто проверять не будет. Все равно всегда можно сказать, "ой, это у нас такая клеточная линия была"...

Comments

[vadperez.livejournal.com]

а для того, чтобы соответствовать всяким ISO следует поступать как Дзюнко. В мануале (в хорошем мануале) должно быть прописана и процедура того как нужно подготовить пипетку для анализа.
Она не парится, потомучто она четко следует инструкции; если кто и несет ответственность — то это составитель инструкции.

А самодеятельность в этих случаях очень жестоко карается.

[aridmoors.livejournal.com]

Не знаю. Возможно лучше делать как она. Я просто не могу как она. Мне надо знать, что ОЗНАЧАЮТ те данные, которые я получила. Ее это не парит. Возмоно, это правильнее.

[vadperez.livejournal.com]

я подумал.. такими вещами по идее занимаются индустриальные траблшутеры. По идее, если технология заказана, тиражируется и потом начинает сбоить. Но после налаживания в итоге всё равно придется переводить в инструкции. А если у них есть рисеч отдел, которое составило эту инсрукцию, тебя будут там от всей души ненавидеть.

Вот будет у тебя лаба. Ты будешь передавать знания своим студентам через вот такую для них алхимию? Для них же на пипетке написано "100 мкл" — это значит что там будет 100 мкл.

[aridmoors.livejournal.com]

Ну я бы хотела чтобы мои стуенты задавались глоабоьными вопросами типа, " а скока там погрешность на пипетке и когда ее надо калибровать"

Впрочем, у меня вряд ли будет своя лаба кгда-нибдуь.

Я надеюсь что сенсей меня продержит сколько сможет. А это значит до моей смерти.

[vadperez.livejournal.com]

самая большая глупость — считать, что что-то будет длиться бесконечно. Ну, наука сейчас в этом состоянии, период кризиса. но не будет же так бесконечно.
Восстанавливать-то кто все это будет, а?

[aridmoors.livejournal.com]

Я не доживу))) поэтому пусть делают чо хотят)))

[vadperez.livejournal.com]

халва, халва..

[progzi2.livejournal.com]

>я бы хотела чтобы мои стуенты задавались глоабоьными вопросами типа, " а скока там погрешность на пипетке и когда ее надо калибровать"

хахаха, ну это-то точно и не глобальный вопрос, и не тот вопрос, из-за которого большинство людей идет в науку.
глобальный вопрос- это суть открытий, новые знания и модели мира. А пипетки несут лишь инструментальную ценность.

[aridmoors.livejournal.com]

Это вопрос, который непосредственно связан с тем, как получаются глобальные знания: человек должен понимать ЧТО он делает.

[progzi2.livejournal.com]

это просто разные уровни абстракции и анализа.
измерительные приборы и софт для анализа данных можно и на уровне отдельных электронов знать.
но обычно человека хватает лишь на {кое-какие представление} + {доверие к разработчикам}.

сам концепт ошибки по определению не должен приводить к положительным результатам (исключением будет если ошибка была определена пост-фактум, когда хотел как лучше, а получилось не так).
а если приводит, то это уже отдельный эксперимент по метрологии или чему-то такому.
и мне странно видеть в коментах такую массовую поддержку подхода "делай быстро с ошибками".

[darkhon.livejournal.com]

Это НЕ научный подход. Уровень лаборанта. Тупого.

[vadperez.livejournal.com]

И, Кэп?

[nil-0.livejournal.com]

Делать по мануалу и усреднять не думая - это результат одной и той же лени разбираться как это работает.

[marvellous-lynx.livejournal.com]

Жесть. Лучше бы не знать этого о науке! Как теперь жить с этим. Если уж в науке так, то что ждать от остальных отраслей.

[freedom_of_sea.livejournal.com]

не, это не перфекционизм. Это системное мышление

[aosypov.livejournal.com]

++

[demiourgos.livejournal.com]

Через какое-то время вас с Дзюнко заменит робот. Но ее уволят, а тебя поставят им руководить (как единственного, кто в лабе может добиться от него повторяемых результатов) ;)

[disput6.livejournal.com]

со стороны для неспециалиста Дзюнко просто приводит в ужас. Как так можно-то вообще, кошмар какой. И это у нас теперь наука???

[aalitvin.livejournal.com]

Вот чего вы никогда не проконтролируете, так это насколько клетки изменились к следующему эксперименту. А они изменились.

[vvz.livejournal.com]

Я бы тут мог прочесть долгую нотацию о том, как стоит измерять количество клеток, если это реально важно (и использовать ATPLite или даже обычный CellTiterGlo для этого совсем не стоит). Будучи ответственным за индустриальные исследования в онкологии, где эти замеры определяли активность веществ и были критическими для продвижения веществ далее, собаку съел на разных методах и реагентах.
Вы правы, Дзюнко нет. Либо опыта не хватает, либо интереса к науке.

[aridmoors.livejournal.com]

Спасибо.

Да, меня тоже напрягло все это. Я никогда не работала с системой АТФ-измерения, и поэтому когда я пришла, мне важно было понять как все работает и зачем именно АТФ. Сенсей мне сказал "потому то нашли коллаборторы это используют". Для меня это не причина ни разу (в научном смысле), я залезла в инет почитать хотя примерно как можно решить этот же вопрос, какие вообще есть эссе, как меряют. Поняла, что их много, и что ни один, взятый в отдельности, не панацея, и вообще для начала надо понять что мы хотим мерять и зачем. Потом, даже с использованием конкретно этого эссе, мне надо знать как конкретно наша машина реагирует на количество реагента, допустим, на присутствие ДМСО самого по себе и так далее. Но это все с точки зрения Дзюнко - не нужно.

Я тогда вопрос задам, можно? У меня вещества себя странно ведут. Я начинаю exposure допустим с 0.001 uM --> 0.005uM --> 0.01 --> 0.05... и так далее. И вот после какого-то порога, скажем там 10 uM, у меня клетки начинают расти лучше. И так несколько веществ себя ведут. Я нифига понять не могу, почему так. Конкретно допустим amiodarone, cyclosporin A.
Причем я знаю (в мануалах этих написано) что типа иногда наблюдается "лучше рост временно в качестве ответа клеток на стресс" (я считаю это bullshit, какой ответ на стресс? Добавьте нокодазола, весь "ответ на стресс" пропадет нахрен, всё как следует подохнет, как положено) - но я после какого-то порога не могу добиться подыхания клеток. Причем я пробовала уже и даже 10.000uM, без разницы, они не реагруют.
Я уж думаю, мож на таких концентрациях у меня тупо не растворяется в ДМСО и он не достигает клеток? Не могу понять что происходит.

И как бы вы стали измерять количество клеток если это реально важно?

[vvz.livejournal.com]

Самый надежный и дешёвый способ - тарелки с прозрачным дном, Hoechst, микроскоп и ImageJ. Считаете количество помеченных Hoechst клеточных ядер и всё.

Следующий по надёжности - CyQuant Direct (именно direct). Те же тарелки с прозрачным дном, клетки в среде без phenol red, капаете реагент, он связывается опять-таки с ДНК и считаете общий сигнал по «колодцу».

CellTiterGlo 2.0 уже менее надёжен, но из ATP методов лучший, на мой взгляд. И то, его лучше применять в 1:10 от концентрации от того, что требует мануал. При слишком высоких концентрациях там начинается ломаться линейность сигнала - общая беда этих реагентов. Причину я точно не знаю. Разговоры про стресс и рост клеток считаю, как и вы, ерундой.

Худший реагент из того, что я пользовал ATPLite. Нестабильный, чувствительный к чихам и колебаниям нейтрино на орбите Урана ;-) но самый дешёвый из всей линейки и потому активно используемый в академии.

У меня есть несколько слайдов на эту тему. Прислать, чтоб вы поделились с коллегами и разными там Дзюнко?

[aridmoors.livejournal.com]

Хекстом мерить наверное не получится, т.к. надо намерить много колодцев...

Я использую CellTiterGlo, типа мне его сказали использовать. Да, спасибо что сказали что 1:10 от концентрации. Я тоже че-то заподозрила что а не много ли сигнала в этой концентрации? У меня только вопрос, если его лить настолько меньше, будут ли клетки растворяться?

Если есть слады, пришлите пожалуйста. На гмыло yulia.riken, если можно. Спасибо!

[vvz.livejournal.com]

А способа быстро двигать тарелку на микроскопе нет? У нас automatic stage на никоновском микроскопе и тарелка двигается сама.

Обычная концентрация... ну, она лучше всего продаётся :-) а разводить можно вплоть до 1:20, но 10-12 кратное разведение мы нашли наиболее стабильным. Кстати, если разведённый сигнал будет выше, чем при прямом использовании, не удивляйтесь. Мы тоже это наблюдали, но причину не выяснили.

CTG измеряет здоровье клеток, а не их количество. Большие клетки с большими митохондриями дадут иной результат, чем маленькие клетки при равном количестве. Клетки, которые ушли в dormancy, будут показывать почти нулевой результат на CTG, но стоит вымыть лекарство, которые вызвало такой эффект, и у тебя снова большой CTG сигнал.

Послал вам файл. Получили?

[progzi2.livejournal.com]

>Либо опыта не хватает, либо интереса к науке.

виной тому культивируемые романтические представления о научной деятельности, которая на самом деле на 99% состоит из вот такого тупого рутинного китайского брутфорса проблем, который не только тягостен психологически, но и оскорбителен для интеллекта некоторых людей.

иными словами, фактически всё время сознание занято калибровкой и т.п. вместо больших интересных вопросов (а пипетки [в теории] должны быть калибруемы автоматически).

[aridmoors.livejournal.com]

Нет, не вся наука из этого состоит. Я сама видела

[ultranomad.livejournal.com]

Интересно, а вообще сейчас биологам в Японии преподают метрологию и статистику? А то у Дзюнко в них явный пробел.

[aridmoors.livejournal.com]

Насколько я знаю, не преподают, причем не только в Японии, а вообще, и у ВСЕХ биологов вот так как у Дзюнко, это я такая, типа меня советские люди учили, погибшая империя.

[horsehorse.livejournal.com]

Я где-то посредине между вами и Дзюнко.
Сначала делаю всё строго по протоколу, потом начинаю варьировать, исключительно по одному из параметров за раз. Довольно часто удаётся этот самый протокол оптимизировать. Я электронщик правда, но подход же общий.

[aridmoors.livejournal.com]

Да, я так же бы делала, но у меня времени нет варьировать 1 параметр за раз. Я пытаюсь уложиться по срокам, поэтому делаю сразу и много. Тут жопа по срокам, никак просто.

[horsehorse.livejournal.com]

Хорошо когда чётко понимаешь что делаешь. Тогда есть возможность сманеврировать по месту и на этом сэкономить.

[rei-tanna.livejournal.com]

Мне кажется, у Дзюнко довольно стандартный подход. Не знаю, для японских ученых, или везде в мире так, но именно в Японии же во всех сферах преобладает строгое следование инструкциям без особой рефлексии. Напомнило историю с котом в микроволновке) не написано, что нельзя - значит, можно. Не написано про калибровку и пузыри - значит, неважно. Аккуратно выполняем, если что мы не виноваты.

[aridmoors.livejournal.com]

Проблема же еще и в том, что в мануалах ни разу не ВСЁ написано. Сейчас же эти коммерческие тайны. Хрен они тебе реально ВАЖНУЮ информацию напишут.((((

А что с котом в микроволновке?

[rei-tanna.livejournal.com]

Вот действительно интересно, неужели сокрытие важных особенностей применения реагентов и методов как-то позитивно влияет на коммерческий успех? Мне казалось должно быть наоборот - чем точнее и лучше все работает, тем популярнее?

Про кота в микроволновке это ж старая анекдотичная история о следовании правилам. Ну, на микроволновках не было написано, что там нельзя сушить котов, и кто-то попытался. Бедное животное. Подал в суд, выиграл, теперь пишут. И на стаканчиках в маке пишут "осторожно, горячо". Потому что если не написано, то никто не догадается. Вот интересно, если вы расскажете Дзюнко о своих наблюдениях, что-то изменится? Или будет "заннен, демо шиката га най", нельзя брать 1:10 от разведения, это против мануала. Ну да, мануал дурацкий, заннен, но он мануал, и будем делать как там написано.

[smirnfil.livejournal.com]

Стаканчик в маке гораздо более интересная история - в маке стали делать чай/кофе перегретой жидкостью, если воду сжать её можно разогреть выше 100 градусов и естественно это ускоряет процесс заваривания, но поскольку вода перегрета, то после заваривания в стакане ощутимо более горячий кипяток чем при обычном процессе(был горячее изначально, меньше заваривался). Так что маковский чай действительно более горячий(и более опасный - там был суд и компенсации после чего и стали писать надпись).

[aosypov.livejournal.com]

Д. камни возит, а ты собор строишь, если ты понимаешь, о чем я.

И да, усреднять как она - на расстрел.

[aridmoors.livejournal.com]

Меня коробит, когда биологи на голубом глазу считают в экселе standard deviation [sic!!] по трем ячейкам. Они бы и по двум строили, я так подозреваю, если бы эксель позволял.........

[vvz.livejournal.com]

А в чем проблема со Standard deviation на трёх точках? Всё нормально. Ой да ладно вероятность того, что мы примем false null hypothesis as a true, становится 50%, но мы же не можем бесконечно повторять одни и те же эксперименты, они денег и времени стоят, а у нас гранты и дедлайны, и вообще можно и только два раза вместо трёх. А не шёл бы ты, мальчик, со своими придирками, мы всегда так делали и статьи публиковали, и результаты дальше по процессу проводили...

У меня был особенно чувствительный к вариациям в измерениях процесс (синергия двух веществ - там ошибки в измерениях перемножаются и сам алгоритм даёт ещё вариацию). Я делал 16 параллельных измерений, и на меня смотрели как на сумасшедшего.

[aridmoors.livejournal.com]

Со стандартным отклонением на трех точках проблема та, что стандартное отклонение - это статистическое понятие, которое характеризует разброс данных (dispersion). В случае трех точек вероятность того, что эти точки упадут далеко от медианы (в районе 2 сигма) достаточно большая. В случае, если эти три точки там упали, то мы совершим большую ошибку, оценивая стадндарнтное отклонение как маленькое (поскольку оно на самом деле большое - но три точки нам не дали достаточно данных чтобы это обнаружить).

Тот же критерий хи-квадрат указывает в правилах (а стандартное отклонение это частный случай его применения), что для валидной оценки следует иметь как минимум 50 точек.

Если более простым языком, то статистика потому и статистика, что она требует большого количества данных. Грубо говоря, существует очень большая вероятность выпадения подряд трех шестерок на кубике в последовательных его бросках. Чем больше бросков, тем меньше вероятность выпадения подряд трех шестерок. При трех точках она слишком большая. Если же мы возьмем не шестерки, а близкие по значению точки (скажем там, чо у нас в пределах двух сигма если мы берем CellTiterGlo) - то у нас вероятность попадения трех точек одновременно в район двух сигма и при этом далеко от медины - она огромная получается.

Я не знаю понятно я выражаюсь или нет.

[vvz.livejournal.com]

Да я с вами полностью согласен, мой комментарий наверху был сарказмом. Подавляющее большинство химиков и биологов очень слабо себе представляют правильную работу со статистикой. И пытаться их переучить на ходу - неблагодарный труд :-(

[aridmoors.livejournal.com]

Я согласна в целом что селл-титер-гло это в целом настолько резкий уровень измерений, что там не надо больше 4 точек. 4 должно быть достаточно.

Но если в целом смотерть например на куписиар - то 3 точки это идиотизм. 3 точки в куписиар- это суицид.

[vvz.livejournal.com]

3 точки в qPCR это не суицид, это «ну все же так делают, чего вы придираетесь». Хотя, конечно, глядя на некоторые опубликованные результаты, хочется выброситься из окна :-)

[aosypov.livejournal.com]

Позволяет, если вместо функции вставить формулу. Я этого получил когда-то на транскриптомике эпилепсии - две группы по два животных, вуаля - получите дифэкспрессию со статистикой...

[darkhon.livejournal.com]

У тебя правильный научный подход.
Дзюнко-сан -- тупая дура.

[mss-mila.livejournal.com]

у вас описаны разные вещи
отслеживать качество пипетирования, краевой эффект, серию реагентов или партию клеток, режим работы блока какого-нибудь, или иные факторы - это работе по мануалу никак не мешает. Это опыт. Это просто добросовестность, в конце концов.
Точно также как и читать и узнавать про механизмы влияния разных вещей друг на друга, и пытаться разобраться "а почему ".

А вот делать случайные вещи, наводить кучу ошибок, неточностей, обо всем этом думать и не иметь времени для их нормального анализа - я прекрасно понимаю. Я сама такая. И всегда за это ругаю себя. Мало того, я "выросла" как лабораторный человек в такой вот число женской группе с дефицитом методологии ( а это она и есть). И я видела как похожие вещи (не всегда, но) приводили к карго-культу, вместо выхода на истинную картину произошедшего.
(но есс-но никогда так не воспринимались, а воспринималось как уникальное знание, недоступное простым смертным, и я то сейчас так же считаю, что мои бывшие коллеги были неправы вот тут и тут, и определяли пероксидазу чудовищным самопальным методом, а вот я вскрыла их заблуждения, потому что я потом в одиночку еще столько плашек испортила.))) ).
Поэтому тут палка о двух концах. С одной стороны "эксперт. это человек совершавший все возможные ошибки в узкой области " и вы идете по этому пути, другое дело, что базовая методология тоже обычно построена на ошибках сотни людей, и не все они были тупее вас.

[aridmoors.livejournal.com]

В том-то и дело, что в мануале никак не описано отслеживание работы по всем этим парамтрам.

Случайные вещи делать надо. Я пока так для себя определила. Если я не буду делать случайные вещи, наука исчезнет. Начнется производство (производство тупых данных в моем случае). Случайные вещи позволяют мне понять, как строить эксперимент, реальный эксперимент. Перед тем, как его построить, я должна понять, как система функционирует вообще.

И да, я считаю что "все эти люди были тупее меня" - ну а как еще считать, когда я вижу, когда они прям передо мной поступают вот таким образом, как Дзюнко????

[vadperez.livejournal.com]

https://www.anekdot.ru/an/an1907/o190704.html#5

а как же резус??

[peggy-s.livejournal.com]

Делать как Дзюнко если от природы так не умеешь - очень саморазрушительно, мне кажется. Это получается не результат, а фигня какая-то, которой не выходит радоваться и процесс тоже перестает быть интересным.

[ystalyy.livejournal.com]

Вообще вы описали профнепригодность.

Но спасибо вам за конкретные примеры.