aridmoors: (Default)
[personal profile] aridmoors
Сил вообще нет. Надо делать кучу экспериментов, включая сегодня - не смогла доделать, завтра надо будет идти доделывать. Сегодня тоже наблюдала, как Дзюнко делает тот же самый эксперимент, что и я, и поняла, что я совсем не так делаю вещи, как остальные. Может быть это плохо, может быть хорошо, я еще не определилась. Когда-то, когда я была студентом, я пробовала разные способы выполнения задачи "биологический эксперимент". Можно делать как? Есть два способа.

1. Прочитать все мануалы и делать все мееееедленно, прямо по мануалу, как написано. Сделать один раз и получить один результат.
2. Делать тупо КАК МОЖНО БОЛЬШЕ. Вот просто тупо делаешь как можно больше раз, делаешь как можно больше вариаций, просто тупо ДЕЛАЕШЬ БОЛЬШЕ.

Щас объясню разницу. Например, мы делаем скажем, АТФ-эссе. Это такой эксперимент, когда насыпаешь клетки в тарелку с 96 колодцами. Потом, там, в каждый колодец насыпаешь разное количество химиката, ждешь 1 день, потом применяешь в каждый колодец АФТ-реагент, и идешь измерять на машине сколько клеток подохло. Все это на слух выглядит очень прикольно и все такое, но тут начинаются нюансы. Например, клетки могут расти с разной скоростью в зависимости от того, сколько ты их насыпал. Поэтому допустим ты насыпал одно количество - получил результат, насыпал другое - получил другой. Потом, нюансы могут быть в том, что у тебя получаемые цифры будут зависеть от количества медицма, от количества АТФ-реагента, от чего угодно. В том числе если высокие концентрации вещества, допустим, результаты тоже могут давать более высокую цифру за счет отражения от стенок колодца и т.п. Много нюансов.

И вот Дзюнко делает как? Она делает все медленно и по мануалу. А я делаю все очень быстро, но зато делаю много ошибок. В результате моих ошибок мне становится интуитивно известно очень много вещей. Например, я уже знаю, что будет влиять на результат, а что нет. Я знаю, например, что полученные измерения будут больше всего зависеть вовсе не от количества клеток (как ни парадоксально), а от того сколько АТФ-реагента налить. Разница в 10 микролитров - уже хз какую разницу в цифрах даст. Соответственно, если ты ошибся на 10 микролитров - можешь сказать до свидания нормальным результатам. От количества медиума охрененно зависит. Поэтому если у тебя мульти-пипетка, которая хреново функционирует по краям, скажем (плохо насасывает), и ошибается там на те же 10 микролитров, у тебя погрешность вылетит за всякие рамки и ничем не пофиксишь.

Но! Но. Когда у меня накапливается массив всех этих знаний, я начинаю знать, как сделать по _своему_ протоколу, чтобы минимизировать погрешность.

Поэтому сегодня была очень странная картина. АТФ-реагент делается из добавления одной жидкости к порошку. Я по опыту знаю, что КАК ты смешиваешь эти вещи - абсолютно фиолетово, поэтому я тупо открываю один бутылек (с жидкостью), открываю другой (с порошком) да и наливаю жидкость в порошок. А слева от меня сидит Дзюнко и делают эту процедуру, знаете, когда берешь шприц, набираешь в него жидкость, протыкаешь эту резиновую крышечку и мееедленно вводишь жидкость с помощью шприца. У нее на это уходит час, у меня на все про все 5 минут. Зато я гораздо больше обращаю внимание на те вещи, которые важны: что надо следить за этой долбаной мульти-пипеткой, что надо следить чтобы все клетки растворились, что надо посдувать все пузыри, которые образуются (потому что иначе они работают как линза и корявят результаты потом) и т.д.

Я так и не знаю, хорошо ли это или плохо. Я могу сказать только, что я не в состоянии (у меня моя дурацкая совесть не позволяет) работать с системой и не понимать, как она работает.Я должна знать, чо за машина, чо она меряет, как она меряет, откуда она считывает, что именно считывает, какова погрешность, что больше всего влияет на систему, где провести срешхолд и так далее... А Дзюнко на белом глазу может делать по мануалу, тратить тучу времени, получить для каждой дозы реагента 2 (прописью: ДВЕ) цифры, УСРЕДНИТЬ их, и выдать за результат. При этом когда я ее прошу показать сырые данные, это пипец, у меня уши в трубочку сворачиваются. Она усредняет цифры с ТАКОЙ погрешностью, что мне страшно. Волосы дыбом. Получила две цифры, которые говорят об АБСОЛЮТНО разном результате, взяла усреднила и успокоилась...

Я так просто не могу. Если я вижу цифры, мне надо чтоб машина мне их выдавала всегда, постоянно, идеально. Я не могу когда у меня два одинаковых образца, один намерялся как 250,000, а второй как 350,000 (при том что соседний образец в котором в два раза меньше клеток намерялся как 150,000!) - я просто не могу усреднять такие цифры в здравом уме.

Это наверное горе от ума. Вот Дзюнко живет и не парится. Делает себе хрень какую-то 1 раз, не повторяет, ну все же по мануалу сделано... блин. Не знаю. У меня явно перфекционизм. Всем же насрать. Надо тупо взять и забить. Не искать истину. Не делать как надо. Все равно никто проверять не будет. Все равно всегда можно сказать, "ой, это у нас такая клеточная линия была"...

Date: 2019-08-24 06:25 pm (UTC)
From: [identity profile] vvz.livejournal.com
Я бы тут мог прочесть долгую нотацию о том, как стоит измерять количество клеток, если это реально важно (и использовать ATPLite или даже обычный CellTiterGlo для этого совсем не стоит). Будучи ответственным за индустриальные исследования в онкологии, где эти замеры определяли активность веществ и были критическими для продвижения веществ далее, собаку съел на разных методах и реагентах.
Вы правы, Дзюнко нет. Либо опыта не хватает, либо интереса к науке.

Date: 2019-08-24 11:55 pm (UTC)
From: [identity profile] aridmoors.livejournal.com
Спасибо.

Да, меня тоже напрягло все это. Я никогда не работала с системой АТФ-измерения, и поэтому когда я пришла, мне важно было понять как все работает и зачем именно АТФ. Сенсей мне сказал "потому то нашли коллаборторы это используют". Для меня это не причина ни разу (в научном смысле), я залезла в инет почитать хотя примерно как можно решить этот же вопрос, какие вообще есть эссе, как меряют. Поняла, что их много, и что ни один, взятый в отдельности, не панацея, и вообще для начала надо понять что мы хотим мерять и зачем. Потом, даже с использованием конкретно этого эссе, мне надо знать как конкретно наша машина реагирует на количество реагента, допустим, на присутствие ДМСО самого по себе и так далее. Но это все с точки зрения Дзюнко - не нужно.

Я тогда вопрос задам, можно? У меня вещества себя странно ведут. Я начинаю exposure допустим с 0.001 uM --> 0.005uM --> 0.01 --> 0.05... и так далее. И вот после какого-то порога, скажем там 10 uM, у меня клетки начинают расти лучше. И так несколько веществ себя ведут. Я нифига понять не могу, почему так. Конкретно допустим amiodarone, cyclosporin A.
Причем я знаю (в мануалах этих написано) что типа иногда наблюдается "лучше рост временно в качестве ответа клеток на стресс" (я считаю это bullshit, какой ответ на стресс? Добавьте нокодазола, весь "ответ на стресс" пропадет нахрен, всё как следует подохнет, как положено) - но я после какого-то порога не могу добиться подыхания клеток. Причем я пробовала уже и даже 10.000uM, без разницы, они не реагруют.
Я уж думаю, мож на таких концентрациях у меня тупо не растворяется в ДМСО и он не достигает клеток? Не могу понять что происходит.

И как бы вы стали измерять количество клеток если это реально важно?

Date: 2019-08-25 04:46 am (UTC)
From: [identity profile] vvz.livejournal.com
Самый надежный и дешёвый способ - тарелки с прозрачным дном, Hoechst, микроскоп и ImageJ. Считаете количество помеченных Hoechst клеточных ядер и всё.

Следующий по надёжности - CyQuant Direct (именно direct). Те же тарелки с прозрачным дном, клетки в среде без phenol red, капаете реагент, он связывается опять-таки с ДНК и считаете общий сигнал по «колодцу».

CellTiterGlo 2.0 уже менее надёжен, но из ATP методов лучший, на мой взгляд. И то, его лучше применять в 1:10 от концентрации от того, что требует мануал. При слишком высоких концентрациях там начинается ломаться линейность сигнала - общая беда этих реагентов. Причину я точно не знаю. Разговоры про стресс и рост клеток считаю, как и вы, ерундой.

Худший реагент из того, что я пользовал ATPLite. Нестабильный, чувствительный к чихам и колебаниям нейтрино на орбите Урана ;-) но самый дешёвый из всей линейки и потому активно используемый в академии.

У меня есть несколько слайдов на эту тему. Прислать, чтоб вы поделились с коллегами и разными там Дзюнко?

Date: 2019-08-25 10:32 am (UTC)
From: [identity profile] aridmoors.livejournal.com
Хекстом мерить наверное не получится, т.к. надо намерить много колодцев...

Я использую CellTiterGlo, типа мне его сказали использовать. Да, спасибо что сказали что 1:10 от концентрации. Я тоже че-то заподозрила что а не много ли сигнала в этой концентрации? У меня только вопрос, если его лить настолько меньше, будут ли клетки растворяться?

Если есть слады, пришлите пожалуйста. На гмыло yulia.riken, если можно. Спасибо!

Date: 2019-08-25 01:07 pm (UTC)
From: [identity profile] vvz.livejournal.com
А способа быстро двигать тарелку на микроскопе нет? У нас automatic stage на никоновском микроскопе и тарелка двигается сама.

Обычная концентрация... ну, она лучше всего продаётся :-) а разводить можно вплоть до 1:20, но 10-12 кратное разведение мы нашли наиболее стабильным. Кстати, если разведённый сигнал будет выше, чем при прямом использовании, не удивляйтесь. Мы тоже это наблюдали, но причину не выяснили.

CTG измеряет здоровье клеток, а не их количество. Большие клетки с большими митохондриями дадут иной результат, чем маленькие клетки при равном количестве. Клетки, которые ушли в dormancy, будут показывать почти нулевой результат на CTG, но стоит вымыть лекарство, которые вызвало такой эффект, и у тебя снова большой CTG сигнал.

Послал вам файл. Получили?

Date: 2019-08-28 08:58 am (UTC)
From: [identity profile] progzi2.livejournal.com
>Либо опыта не хватает, либо интереса к науке.

виной тому культивируемые романтические представления о научной деятельности, которая на самом деле на 99% состоит из вот такого тупого рутинного китайского брутфорса проблем, который не только тягостен психологически, но и оскорбителен для интеллекта некоторых людей.

иными словами, фактически всё время сознание занято калибровкой и т.п. вместо больших интересных вопросов (а пипетки [в теории] должны быть калибруемы автоматически).

Date: 2019-08-28 09:01 am (UTC)
From: [identity profile] aridmoors.livejournal.com
Нет, не вся наука из этого состоит. Я сама видела

Profile

aridmoors: (Default)
aridmoors

January 2026

S M T W T F S
    123
45678910
11121314151617
18192021222324
25262728293031

Style Credit

Expand Cut Tags

No cut tags
Page generated Jan. 20th, 2026 10:40 am
Powered by Dreamwidth Studios