(no subject)
Nov. 23rd, 2016 09:32 pm![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
aridmoorsНадо сходить заморозить стволовые клетки, уже 9 часов вечера, а я сижу и не могу оторваться от пабмеда. Ну фантастика натуральная, намного круче, чем все эти современные книжки с мутанто-чудовищами.
Ну вот например, статья, в которой описан случай исчезнувшей почки. В больницу поступила женщина 60 лет с давним диабетом. Плохо, тошнота, рвота, живот болит. Сделали экстренные анализы - все вроде нормально, только насторожила какая-то странная мягкость, прощупывающаяся в правом боку. Сделали дополнительные анализы - ну да, сахар высокий, в крови продукты протеинового распада. Решили, что диабетический кетоацидоз. Поставили инсулиновую капельницу, через 6 часов сахар ушел, а рвота и боль в животе остались.
Анализ мочи утром показал наличие сброшенных эпителиальных клеток. Женщину быстро на рентген, смотрят - а там на месте правой почки черное пятно. Ее на УЗИ. Узи не нашло правой почки.
Посоветовавшись с урологическим отделением, решили оперировать, и обнаружили, что там заражение и некроз, создавший облако газа, блокировавшего сигнал на диагностике. Женщину спасти не удалось.
Или вот, продолжаю читать про нейробластому. Ну реально, таинственная вещь. В Японии в 70-х годах начали раннюю диагностику этого рака, у шестимесячных детей, в надежде, что если находить его раньше, то будет легче лечить. Результаты диагностики оказались совершенно фантастическими и до сих не объяснены наукой. Они показали, что у младенцев этого рака намного больше, чем думали раньше, но что к двум годам он у многих куда-то девается. Исчезает. Сам. Включая метастазы четвертой степени.
Более того: выяснилось, что ранняя диагностика почему-то не засекает те случаи, которые приводят впоследствии к смерти. Обозначились случаи, когда дети, в 6 месяцев показавшие отрицательный результат на обследовании, через год приходили со смертельными опухолями, на которые их тестировали всего какими-то месяцами раньше. Как? Откуда? Сенситивность теста крайне высокая, не заметить было невозможно. Тайна.
В общем, вот. Надо пойти клетки замораживать.
Ну вот например, статья, в которой описан случай исчезнувшей почки. В больницу поступила женщина 60 лет с давним диабетом. Плохо, тошнота, рвота, живот болит. Сделали экстренные анализы - все вроде нормально, только насторожила какая-то странная мягкость, прощупывающаяся в правом боку. Сделали дополнительные анализы - ну да, сахар высокий, в крови продукты протеинового распада. Решили, что диабетический кетоацидоз. Поставили инсулиновую капельницу, через 6 часов сахар ушел, а рвота и боль в животе остались.
Анализ мочи утром показал наличие сброшенных эпителиальных клеток. Женщину быстро на рентген, смотрят - а там на месте правой почки черное пятно. Ее на УЗИ. Узи не нашло правой почки.
Посоветовавшись с урологическим отделением, решили оперировать, и обнаружили, что там заражение и некроз, создавший облако газа, блокировавшего сигнал на диагностике. Женщину спасти не удалось.
Или вот, продолжаю читать про нейробластому. Ну реально, таинственная вещь. В Японии в 70-х годах начали раннюю диагностику этого рака, у шестимесячных детей, в надежде, что если находить его раньше, то будет легче лечить. Результаты диагностики оказались совершенно фантастическими и до сих не объяснены наукой. Они показали, что у младенцев этого рака намного больше, чем думали раньше, но что к двум годам он у многих куда-то девается. Исчезает. Сам. Включая метастазы четвертой степени.
Более того: выяснилось, что ранняя диагностика почему-то не засекает те случаи, которые приводят впоследствии к смерти. Обозначились случаи, когда дети, в 6 месяцев показавшие отрицательный результат на обследовании, через год приходили со смертельными опухолями, на которые их тестировали всего какими-то месяцами раньше. Как? Откуда? Сенситивность теста крайне высокая, не заметить было невозможно. Тайна.
В общем, вот. Надо пойти клетки замораживать.
![[identity profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/openid.png){kind=small}
no subject
Date: 2016-11-27 03:21 pm (UTC)но, в принципе, да - программа правильная.
С FR - круто
no subject
Date: 2016-11-27 03:56 pm (UTC)Кстати, ещё одну пеменную стоит проверить: материал и покрытие тарелок, в которых растут клетки. TC-treated vs untreated vs CellBind (Corning), polysterene vs polypropelene. Serum is a glue that helps cells attach, that may play a role in proliferation as well. Say, these particular cells require much more motility to proliferate or need to go to suspension stage in their cell cycle in culture.
no subject
Date: 2016-11-27 11:11 pm (UTC)Работаю с mouse neural stem cells.
Клетки эти получены из одной японской лабы и они custom-made, делали их классическим (на настоящий момент) способом co-culture с другими клетками. Насколько они neural - хрен знает, почему их назвали NSC - потому что
1) EGF-FGF dependent growth and proliferation
2) экспрессируют маркеры NSC (Sox2, Nestin, Neurofilament)
3) могут дифференцироваться в астроциты и другие клетки, в которые положено дифференцироваться NSC. Дифференцируются спонтанно, т.е. если оставить расти в тарелке на две недели, не меняя медиум и если при этом они не были слишком confluent (а то расти некуда).
Ну и вот. Эти клетки очень сенситивные. Реагируют на всё. На over-trypsinization, staying in the cold (ex. during FACS), insufficient starting cell number when unfrozen, different surface of the dish (ex. they don't want to grow on glass unless you seed MANY of them and then some survive) etc.
То есть ощущение в целом - это что клетки такие нежные, что на них и подуть нельзя. Пожэтому когда они внезапно начали расти в ответ на serum withdrawal, у меня реально глаз выпал. Тут и HeLa-то дохнет, а эти...
В норме проверенная процедура выращивания клеток следующая:
клетки высаживаются в специальный chemically defined medium called RHB (for neural lineages) and EGF/FGF is added. Тарелка должна быть gelatin-coated, если нет - начинают дохнуть, плохо растут. Если высадить в другой медиум, подохнут совсем.
После того, как они приклеились к тарелке (через 24 часа) медиум меняется либо на DMEM without serum, либо на DMEM 10% FBS. И вот тут начинается: там, где просто ДМЕМ, они растут бешено и выглядят как neural stem cells (длинненькие, мезенхимные, поодиночке, сияют здоровьем), а где серум - там они начинают быть более квадратные, более слипшиеся друг с другом (как эпителиальные) и плохо растут. Поскрасила ki67 - в тарелке с серумом мало позитивных, без серума больше. То есть они уходят в G0 если добавить FBS.
При этом это не обязательно должен быть FBS. Я пробовала сравнивать с RHB и с медиумом для репрограммирования Basal Medium iPS (http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/SRD/Pgro-500.pdf), он типа chemically defined (proprietary, естественно), но там типа нету серума!
Реакция та же.
То есть в серум входит какое-то вещество, которое выделено и обычно добавляется в chemically defined mediums и которое приводит к сдерживанию роста этой линии.
Брать и пытаться изолировать это вещество (добавлять что-нибудь по одному в DMEM, пока не наткнешься?)
Мне бы понять, ПОЧЕМУ они растут без серума. Никто не растет, а они растут. Что они едят, воздух? Как вообще можно начать активный клеточный цикл без серума? Ну хорошо, technically, это получается не serum withdrawal, это убирание какого-то сдерживающего вещества. На это видимо происходит ответ. Типа был ограничитель, его сняли, они на первое время обрадовались и давай размножаться. Первые 36 часов они счастливы, дальше я не проверяла, но расти не должны - они же в самом деле должны что-то жрать. Хотя там глюкоза (я использую Low Glucose DMEM в этом эксперименте), че-то им пожрать все-таки есть на первое время.
Подскажите ваше профессиональное мнение (я так понимаю, вы как раз работаете много с клеточными культурами)!
no subject
Date: 2016-11-28 12:15 am (UTC)- is serum heat-inactivated?
- pH - вы добавляете HEPES в медиа для контроля pH? Какой pH у среды без серума и с ним? А после роста клеток?
- glutamine - в обычном DMEM он уже добавлен в убойном количестве (точнее в уживлённом, он не убивает, а ускоряет рост). Что если таки попробовать colorless DMEM - там помимо отсутствия phenol red, нет ещё и глутамина. Может быть serum в ваших конкретных клетках банально блокирует глутаминовый транспорт? Были работы по amino acid transport blocked by even 1% serum, что и вызвало, AFAIK, избыточный глутамин в коммерческих медиумах.
- в 3d условиях растить не пробовали? Scivax nanoculture plates or Corning ultralow attachment.
В общем, задачка интересная, но в комментах её обсуждать сложно - может, перенести в емэйл?
no subject
Date: 2016-11-27 11:16 pm (UTC)no subject
Date: 2016-11-27 11:17 pm (UTC)1) DMEM+EGF/FGF vs. DMEM+EGF/FGF+serum
2) DMEM vs. DMEM+serum
в первом случае клетки растут с серумом хуже, чем без. Я подумала, что может быть serum binds EGF/FGF and limits its effect on cells, and without it EGF and FGF work better. Отсюда второй эксперимент. Однако во втором эксперименте разница между тарелками стала еще больше (раза в 2 больше), т.е. с серумом они совсем загнулись, а без - они совсем расцвели.
no subject
Date: 2016-11-27 11:40 pm (UTC)