aridmoors | ПЦР ковид

Тут я просто напишу свои мысли про ПЦР, для того чтобы помочь себе думать, как сделать следующую статью. Просто математические статьи у меня плохо пишутся, т.к. я не умею представлять результаты в графиках, ну то есть прежде чем статью писать, надо обдумать, а это процесс медленный и делается где-то внутри.

Под катом размышления про ПЦР и ковид-тест ПЦР. Ну может кому-то и читать будет интересно тоже, я не знаю.

Короче у всех сейчас слово "ПЦР" на слуху, потому что типа ковидные тесты так делаются. Мне тут некоторые товарищи писали злобные комменты, типа я не специалист в ПЦР, не знаю как делается, бла-бла-бла. Так вот нифига. Мало того что я действительно специалист в ПЦР (кандидатскую по нему делала), так я еще и с тех пор продвинулась еще дальше в своих ПЦРных исследованиях, и нашла интересные детали, коие хочу загнать в еще одну статью. Статья будет ругать ковид-тест и как он делается, но ругать не сильно (а даже очень подспудно), поскольку аз есмь не дурак и понимаю, что Большие Шишки, у которых и патенты на этот тест и все прочее, будут сильно-пресильно недовольны, если их кто-то будет критиковать.

Короче, ПЦР-тесты бывают разные (например РНК может перегоняться в ДНК до собственно реакции, или может перегоняться в процессе реакции), но суть ПЦР* одна и та же, химически и математически. Это реально физико-химический процесс, который работает одинаково, на какой бок ты его ни поставь. Но тут, конкретно, я буду рассуждать на примере самого базового ПЦР, который делается абсолютным большинством, на базе красителя SYBR Green (Сайбер).

*В данном случае я веду речь про квантификационный ПЦР, ку-ПЦР (qPCR).

Короче, объяснение для совсем тех кто не в теме.

В общем, как делается тест на ковид? Он делается так: у нас есть образец слюны-клеток-соплей, мы его берем и пытаемся смотреть, есть ли внутри него вирусная РНК или нету. Если есть, то типа вы ковид-позитивный, если нету, то вы ковид-негативный. Перечитайте внимательно предыдущее предложение, потому что это не то, что происходит на самом деле при тесте, а то что разработчики теста утверждают! Они утверждают что типа определяют, есть ковид или нет. Так вот проблема. Для начала, уже само по себе использование именно КВАНТИФИКАЦИОННОГО ПЦР в данном случае ни на чем не основано, потому что квантификационный ПЦР специально сделан не в двоичной системе ("есть-нету"), а в квантификационной системе ("сколько есть"). В этом ОГРОМНАЯ проблема для ковид-теста, потому что по своей природе квантификационный ПЦР работает НАМНОГО хуже, чем обычный двоичный ПЦР в плане есть-нету. Он вообще, если честно, тупо не работает в двоичной системе, ну не работает он так!! Он не для этого сделан!!! С какого перепугу все стали тестить на ковид квантификационно? А ни с какого. В смысле, нет никакой реальной причины, почему именно так. Просто вот разработчики теста так захотели и все. Хотя логичнее было бы применять двоичный ПЦР, потому что мы же пытаемся узнать ЕСТЬ ковид или НЕТ, а двоичный ПЦР НАМНОГО более надежен. Отсюда и имеем все проблемы с тем, что тест либо не работает, либо показывает погоду, и тут же теории заговоров и все прочее. А могло бы все решиться тупо использованием нужной технологии, блин! Ужоснах, но хрен с ним, мир вообще так работает. Не по логике.

Саммари: разработчики теста хотят решить двоичную проблему (есть вирус или нет), а используют для этого СОВЕРШЕННО ДРУГУЮ технологию, которая ВАЩЕ ни разу не подходит для этих целей. Это правда, ей-богу. Ку-ПЦР это не двоичная хрень ни разу, никогда ей не была и никогда не будет.

Суть проблемы в том, что квантификационный ПЦР, вопреки своему названию, НЕ ОЦЕНИВАЕТ абсолютное количество чего бы то ни было (как бы разработчики его ни пытались утверждать обратное). Ку-ПЦР НЕ МОЖЕТ (никогда не мог и никогда не сможет) оценивать абсолютное количество чего бы то ни было. Это я хорошо, на своей шкуре прочувствовала, когда делала кандидатскую. Абсолютная оценка количества молекул методом куПЦР НЕВОЗМОЖНА. Точка.

А тогда возникает вопрос: а что мы меряем? Если мы не можем померять, сколько молекул вируса у нас, но на выходе получаем какое-то число, ЧТО тогда, пардон, это число вообще отражает? Если мы не можем померять сколько молекул вируса, а получили число 25, то ЧО МЫ ПОЛУЧИЛИ?
Ах-ха-ха-ха, дорогая редакция, вы получили, извините мне мою иронию, приблизительно с потолка взятую фигню! И я не шучу. Это именно так и есть в случае ковид-теста.

Вот все эти на форумах обсуждаемые проблемы, про то, сколько циклов надо гонять 40 или 15 - они именно из этого растут. Потому что количество циклов - это именно для квантификационной оценки, а в случае ковида мы блин не хотим узнать СКОКА, мы хотим узнать ЕСТЬ ИЛИ НЕТ. То есть реально взяли не ту технологию и стали исхищряться ее применять туда, где ее и быть не должно вообще.

Пока писала, поняла, что не смогу включить внятное объяснение про количество циклов в пост, потому что слишком многабукв получится. Если кто-то интересуется проблемами про циклы - велкам в комменты, там обсудим. Дальше буду писать только про другую, более релевантную фигню.

Короче говоря, когда вы гоняете ПЦР-тест на ковид на ПЦР-машине, вы получаете два типа данных. Один тип данных это амплификационные кривые (которые отражают возрастание сигнала от цикла к циклу), а второй тип данных это плавильные кривые (которые отражают количество флуоресценции в зависимости от температуры).

Первый тип данных выглядит вот так:

На этой картинке показаны амплификационные кривые. Они имеют форму сигмоид (буква S), и идут примерно экспоненциально снизу вверх. Обратите внимание, что кривые эти расположены не все вместе, а немножко на разном расстоянии, то есть их можно визуально разграничить между собой. Зеленая горизонтальная линия - это так называемая линия трэшхолда, которую проводит компьютер. На каком основании проводит? Никто не знает, потому что эта информация зашита в софт конкретной машины, и не подлежит разглашению [но для фанатиков могу пояснить, что ее можно устанавливать вручную]. Просто компьютер тупо проводит линию и все. Так вот. Цифра, которую вы получаете при ковид-тесте, это то значение по оси Х, где зеленая горизонтальная линия пересекла одну из ваших (с вашими слюнями-соплями) амплификационных кривых.

Еще раз, ваши слюни-сопли, ваш образец, представлен ОДНОЙ сигмоидной кривой. Ваша "циферка" (ваш результат) - это то место, где вашу кривую пересекла горизонтальная линия. Все.

На каком основании тогда выносится диагноз "ковид-позитивный" или "ковид-негативный"? А ни на каком. На случайном. Вот оператор машины решил, что все точки пересечения которые до цифры 30 это положительный результат, а те точки которые за 30, это отрицательный. Все. Все люди, чьи точки до 30, получают типа "ковид-положителен", а все люди которые после 30, получают "ковид-отрицательный". Все.

Нет, реально все. Там нету объективного фактора, никто реально не проверяет ваши слюни, есть там вирус или нет. Их просто вот так гоняют на машине, получают вот эти загогулины, и потом РЕАЛЬНО с потолка берут типа, а давайте все которые до 30 это положительные, а которые после 30 это отрицательные. Доказательства конкретно в этом эксперименте НЕТ. (И не предвидится). Я не шучу, это реально так и делается. Никто реально ваши слюни не проверяет, их реально вот так гоняют на машине и реально вот так с потолка решают, где провести рубеж.

В чем проблема? А в том, что эти кривые могут быть построены по ЛЮБОЙ (с потолка взятой) ДНК (или РНК, неважно). ЧТО там в машине произошло, какой кусок умножился, откуда взялась эта кривая, вот конкретно по этой картинке сказать нельзя ВООБЩЕ. Если у вас случайно в организме такой генотип, что у вас случайно умножилась не вирусная РНК, а че-то другое, вы ВСЕ РАВНО получите вот эту кривую и вот эту цифру. Эта кривая БУДЕТ В ЛЮБОМ СЛУЧАЕ. Так это работает. Конкретно эта технология. На чем основана эта кривая, по этой кривой, этим графикам сказать нельзя. То есть это гадание на кофейной гуще, literally.

Так вот. Идем теперь ко второму типу данных, которые тоже получаются при таком эксперименте. Плавильные кривые.
Плавильные кривые выглядят вот так.

Вот тут уже смотрите внимательно. Мы имеем кривые (в этом примере много штук), которые идут в районе типа "горизонтально-горизонтально", потом резко вверх и резко вниз. Так вот. Вот такие кривые (плавильные) имеют одно ОЧЕНЬ важное свойство. Их пик (то место, где они все в наивысшей точке) ОЧЕНЬ воспроизводим для определенного конкретного куска ДНК или РНК. По оси Х у нас в этом случае идет температура плавления. Так вот. В КАЖДОМ конкретном случае, для любого куска ДНК, эта температура пика (температура плавления) различна. Другими словами, если мы гоняем ковид-РНК, у нас температура плавления будет скажем 98.33. Если мы гоняем другой ген (любой другой), у нас температура плавления будет другая. Это я проверила на большом количестве генов. Температура пика имеет ошибку в районе десятых долей градуса(!!). То есть если бы мы, вместо смотрения на картинку 1 выше (амплификационные кривые), смотрели бы на картинку 2 (плавильные кривые), мы могли бы получить ДЕЙСТВИТЕЛЬНЫЙ результат с точностью до 0.01 градуса.

То есть, тупо, если бы сейчас эти ~~дебилы~~ люди перестали гадать на кофейной гуще по амплификационным кривым, а стали бы смотреть на плавильные кривые, мы могли бы иметь ковид-тест, который бы НЕ ОШИБАЛСЯ. Просто потому что КАЖДЫЙ кусок ДНК или РНК плавится строго по определенным законам со значением температуры плавления, которая воспроизводится ОЧЕНЬ точно, в районе десятых долей градуса.

Короче как-то так. В общем это был пост, который я писала для себя, чтобы помочь себе понять, как строить статью. Разумеется все это подкреплено экспериментально (в смысле я реально гоняла все реакции на машине и т.д. и т.п.). Большого шума я все равно не наделаю, и все это абсолютно безынтересно разработчикам теста на ковид, и я вам уже сейчас скажу, что никто не обратит на меня никакого внимания. И что ситуация с тестом на ковид не поменяется, и никто не станет смотреть на плавильные кривые. Они тупо не смотрят и не будут смотреть.

И вообще это все exercise in futility.
Но я чисто для себя нашла вот такую штуку, что определенный кусок ДНК имеет настолько точную плавильную температуру, что она как индикатор НАМНОГО точнее каких бы то ни было амплификационных кривых. И была бы спасением от проблем тестирования.

Page 1 of 2 << [1] [2] >>

Flat | Top-Level Comments Only

From:

occuserpens.livejournal.com

Ничего конкретно в PCR не понимая, как тупой программист могу задать 2 вопроса.
Как насчет технологичности плавильного тестирования, насколько оно реально в массовой реализации по сравнению с принятой?
Как насчет верификации? Взять, например, неслолько сот, а лучше тысяч образцов и сравнить, как отлавливаются реально заболевшие / инфекционные.

From:

aridmoors.livejournal.com

плавильное тестирование реально, если бы кто-то захотел. Но они не хотят и не будут хотеть.

Насчет верификации, реальной верификацие может быть только секвенирование образцов. Это они тоже никогда не будут применять. Это слишком затратно.

Счастье с несчастьем на одних санях ездят

ПЦР ковид

Page Summary

Style Credit

Expand Cut Tags