aridmoors: (Default)
[personal profile] aridmoors
Тут я просто напишу свои мысли про ПЦР, для того чтобы помочь себе думать, как сделать следующую статью. Просто математические статьи у меня плохо пишутся, т.к. я не умею представлять результаты в графиках, ну то есть прежде чем статью писать, надо обдумать, а это процесс медленный и делается где-то внутри.

Под катом размышления про ПЦР и ковид-тест ПЦР. Ну может кому-то и читать будет интересно тоже, я не знаю.



Короче у всех сейчас слово "ПЦР" на слуху, потому что типа ковидные тесты так делаются. Мне тут некоторые товарищи писали злобные комменты, типа я не специалист в ПЦР, не знаю как делается, бла-бла-бла. Так вот нифига. Мало того что я действительно специалист в ПЦР (кандидатскую по нему делала), так я еще и с тех пор продвинулась еще дальше в своих ПЦРных исследованиях, и нашла интересные детали, коие хочу загнать в еще одну статью. Статья будет ругать ковид-тест и как он делается, но ругать не сильно (а даже очень подспудно), поскольку аз есмь не дурак и понимаю, что Большие Шишки, у которых и патенты на этот тест и все прочее, будут сильно-пресильно недовольны, если их кто-то будет критиковать.

Короче, ПЦР-тесты бывают разные (например РНК может перегоняться в ДНК до собственно реакции, или может перегоняться в процессе реакции), но суть ПЦР* одна и та же, химически и математически. Это реально физико-химический процесс, который работает одинаково, на какой бок ты его ни поставь. Но тут, конкретно, я буду рассуждать на примере самого базового ПЦР, который делается абсолютным большинством, на базе красителя SYBR Green (Сайбер).

*В данном случае я веду речь про квантификационный ПЦР, ку-ПЦР (qPCR).

Короче, объяснение для совсем тех кто не в теме.

В общем, как делается тест на ковид? Он делается так: у нас есть образец слюны-клеток-соплей, мы его берем и пытаемся смотреть, есть ли внутри него вирусная РНК или нету. Если есть, то типа вы ковид-позитивный, если нету, то вы ковид-негативный. Перечитайте внимательно предыдущее предложение, потому что это не то, что происходит на самом деле при тесте, а то что разработчики теста утверждают! Они утверждают что типа определяют, есть ковид или нет. Так вот проблема. Для начала, уже само по себе использование именно КВАНТИФИКАЦИОННОГО ПЦР в данном случае ни на чем не основано, потому что квантификационный ПЦР специально сделан не в двоичной системе ("есть-нету"), а в квантификационной системе ("сколько есть"). В этом ОГРОМНАЯ проблема для ковид-теста, потому что по своей природе квантификационный ПЦР работает НАМНОГО хуже, чем обычный двоичный ПЦР в плане есть-нету. Он вообще, если честно, тупо не работает в двоичной системе, ну не работает он так!! Он не для этого сделан!!! С какого перепугу все стали тестить на ковид квантификационно? А ни с какого. В смысле, нет никакой реальной причины, почему именно так. Просто вот разработчики теста так захотели и все. Хотя логичнее было бы применять двоичный ПЦР, потому что мы же пытаемся узнать ЕСТЬ ковид или НЕТ, а двоичный ПЦР НАМНОГО более надежен. Отсюда и имеем все проблемы с тем, что тест либо не работает, либо показывает погоду, и тут же теории заговоров и все прочее. А могло бы все решиться тупо использованием нужной технологии, блин! Ужоснах, но хрен с ним, мир вообще так работает. Не по логике.

Саммари: разработчики теста хотят решить двоичную проблему (есть вирус или нет), а используют для этого СОВЕРШЕННО ДРУГУЮ технологию, которая ВАЩЕ ни разу не подходит для этих целей. Это правда, ей-богу. Ку-ПЦР это не двоичная хрень ни разу, никогда ей не была и никогда не будет.

Суть проблемы в том, что квантификационный ПЦР, вопреки своему названию, НЕ ОЦЕНИВАЕТ абсолютное количество чего бы то ни было (как бы разработчики его ни пытались утверждать обратное). Ку-ПЦР НЕ МОЖЕТ (никогда не мог и никогда не сможет) оценивать абсолютное количество чего бы то ни было. Это я хорошо, на своей шкуре прочувствовала, когда делала кандидатскую. Абсолютная оценка количества молекул методом куПЦР НЕВОЗМОЖНА. Точка.

А тогда возникает вопрос: а что мы меряем? Если мы не можем померять, сколько молекул вируса у нас, но на выходе получаем какое-то число, ЧТО тогда, пардон, это число вообще отражает? Если мы не можем померять сколько молекул вируса, а получили число 25, то ЧО МЫ ПОЛУЧИЛИ?
Ах-ха-ха-ха, дорогая редакция, вы получили, извините мне мою иронию, приблизительно с потолка взятую фигню! И я не шучу. Это именно так и есть в случае ковид-теста.

Вот все эти на форумах обсуждаемые проблемы, про то, сколько циклов надо гонять 40 или 15 - они именно из этого растут. Потому что количество циклов - это именно для квантификационной оценки, а в случае ковида мы блин не хотим узнать СКОКА, мы хотим узнать ЕСТЬ ИЛИ НЕТ. То есть реально взяли не ту технологию и стали исхищряться ее применять туда, где ее и быть не должно вообще.

Пока писала, поняла, что не смогу включить внятное объяснение про количество циклов в пост, потому что слишком многабукв получится. Если кто-то интересуется проблемами про циклы - велкам в комменты, там обсудим. Дальше буду писать только про другую, более релевантную фигню.

Короче говоря, когда вы гоняете ПЦР-тест на ковид на ПЦР-машине, вы получаете два типа данных. Один тип данных это амплификационные кривые (которые отражают возрастание сигнала от цикла к циклу), а второй тип данных это плавильные кривые (которые отражают количество флуоресценции в зависимости от температуры).

Первый тип данных выглядит вот так:
IL24

На этой картинке показаны амплификационные кривые. Они имеют форму сигмоид (буква S), и идут примерно экспоненциально снизу вверх. Обратите внимание, что кривые эти расположены не все вместе, а немножко на разном расстоянии, то есть их можно визуально разграничить между собой. Зеленая горизонтальная линия - это так называемая линия трэшхолда, которую проводит компьютер. На каком основании проводит? Никто не знает, потому что эта информация зашита в софт конкретной машины, и не подлежит разглашению [но для фанатиков могу пояснить, что ее можно устанавливать вручную]. Просто компьютер тупо проводит линию и все. Так вот. Цифра, которую вы получаете при ковид-тесте, это то значение по оси Х, где зеленая горизонтальная линия пересекла одну из ваших (с вашими слюнями-соплями) амплификационных кривых.

Еще раз, ваши слюни-сопли, ваш образец, представлен ОДНОЙ сигмоидной кривой. Ваша "циферка" (ваш результат) - это то место, где вашу кривую пересекла горизонтальная линия. Все.

На каком основании тогда выносится диагноз "ковид-позитивный" или "ковид-негативный"? А ни на каком. На случайном. Вот оператор машины решил, что все точки пересечения которые до цифры 30 это положительный результат, а те точки которые за 30, это отрицательный. Все. Все люди, чьи точки до 30, получают типа "ковид-положителен", а все люди которые после 30, получают "ковид-отрицательный". Все.

Нет, реально все. Там нету объективного фактора, никто реально не проверяет ваши слюни, есть там вирус или нет. Их просто вот так гоняют на машине, получают вот эти загогулины, и потом РЕАЛЬНО с потолка берут типа, а давайте все которые до 30 это положительные, а которые после 30 это отрицательные. Доказательства конкретно в этом эксперименте НЕТ. (И не предвидится). Я не шучу, это реально так и делается. Никто реально ваши слюни не проверяет, их реально вот так гоняют на машине и реально вот так с потолка решают, где провести рубеж.

В чем проблема? А в том, что эти кривые могут быть построены по ЛЮБОЙ (с потолка взятой) ДНК (или РНК, неважно). ЧТО там в машине произошло, какой кусок умножился, откуда взялась эта кривая, вот конкретно по этой картинке сказать нельзя ВООБЩЕ. Если у вас случайно в организме такой генотип, что у вас случайно умножилась не вирусная РНК, а че-то другое, вы ВСЕ РАВНО получите вот эту кривую и вот эту цифру. Эта кривая БУДЕТ В ЛЮБОМ СЛУЧАЕ. Так это работает. Конкретно эта технология. На чем основана эта кривая, по этой кривой, этим графикам сказать нельзя. То есть это гадание на кофейной гуще, literally.

Так вот. Идем теперь ко второму типу данных, которые тоже получаются при таком эксперименте. Плавильные кривые.
Плавильные кривые выглядят вот так.

trip6-sw480

Вот тут уже смотрите внимательно. Мы имеем кривые (в этом примере много штук), которые идут в районе типа "горизонтально-горизонтально", потом резко вверх и резко вниз. Так вот. Вот такие кривые (плавильные) имеют одно ОЧЕНЬ важное свойство. Их пик (то место, где они все в наивысшей точке) ОЧЕНЬ воспроизводим для определенного конкретного куска ДНК или РНК. По оси Х у нас в этом случае идет температура плавления. Так вот. В КАЖДОМ конкретном случае, для любого куска ДНК, эта температура пика (температура плавления) различна. Другими словами, если мы гоняем ковид-РНК, у нас температура плавления будет скажем 98.33. Если мы гоняем другой ген (любой другой), у нас температура плавления будет другая. Это я проверила на большом количестве генов. Температура пика имеет ошибку в районе десятых долей градуса(!!). То есть если бы мы, вместо смотрения на картинку 1 выше (амплификационные кривые), смотрели бы на картинку 2 (плавильные кривые), мы могли бы получить ДЕЙСТВИТЕЛЬНЫЙ результат с точностью до 0.01 градуса.

То есть, тупо, если бы сейчас эти дебилы люди перестали гадать на кофейной гуще по амплификационным кривым, а стали бы смотреть на плавильные кривые, мы могли бы иметь ковид-тест, который бы НЕ ОШИБАЛСЯ. Просто потому что КАЖДЫЙ кусок ДНК или РНК плавится строго по определенным законам со значением температуры плавления, которая воспроизводится ОЧЕНЬ точно, в районе десятых долей градуса.

Короче как-то так. В общем это был пост, который я писала для себя, чтобы помочь себе понять, как строить статью. Разумеется все это подкреплено экспериментально (в смысле я реально гоняла все реакции на машине и т.д. и т.п.). Большого шума я все равно не наделаю, и все это абсолютно безынтересно разработчикам теста на ковид, и я вам уже сейчас скажу, что никто не обратит на меня никакого внимания. И что ситуация с тестом на ковид не поменяется, и никто не станет смотреть на плавильные кривые. Они тупо не смотрят и не будут смотреть.

И вообще это все exercise in futility.
Но я чисто для себя нашла вот такую штуку, что определенный кусок ДНК имеет настолько точную плавильную температуру, что она как индикатор НАМНОГО точнее каких бы то ни было амплификационных кривых. И была бы спасением от проблем тестирования.
Page 1 of 6 << [1] [2] [3] [4] [5] [6] >>

Date: 2021-01-10 03:56 am (UTC)
From: [identity profile] occuserpens.livejournal.com
Ничего конкретно в PCR не понимая, как тупой программист могу задать 2 вопроса.
Как насчет технологичности плавильного тестирования, насколько оно реально в массовой реализации по сравнению с принятой?
Как насчет верификации? Взять, например, неслолько сот, а лучше тысяч образцов и сравнить, как отлавливаются реально заболевшие / инфекционные.

Date: 2021-01-10 05:11 am (UTC)
From: [identity profile] aridmoors.livejournal.com
плавильное тестирование реально, если бы кто-то захотел. Но они не хотят и не будут хотеть.

Насчет верификации, реальной верификацие может быть только секвенирование образцов. Это они тоже никогда не будут применять. Это слишком затратно.

Date: 2021-01-10 05:26 am (UTC)
From: [identity profile] prostokomp.livejournal.com
Поэтому и придумали ковид-бессимптомных :)

четкое объяснение

Date: 2021-01-10 06:27 am (UTC)
From: [identity profile] shchedrin56.livejournal.com
почти все понял и то что понял нравится ! Вам большое спасибо

Date: 2021-01-10 06:35 am (UTC)
From: [identity profile] pavel the great (from livejournal.com)
Kary Mullis давал пару интервью про то как они стали использовать pcr в странных целях, про Фауччи и прочих недоразумений на почве науки и их странные делишки. Ну и он сам достаточно "вовремя" умер в 2019г, сейчас бы ему было что рассказать про этих "гениев". Он если что изобретатель pcr.
From: [identity profile] altolik.livejournal.com
и фамилия автора.хотелось бы попробовать понять глубже т.ск. альфу и омегу теоретических подходов

пцр и ковидла

Date: 2021-01-10 08:02 am (UTC)
From: [identity profile] livejournal.livejournal.com
User [livejournal.com profile] leonid_smetanin referenced to your post from пцр и ковидла (https://leonid-smetanin.livejournal.com/134240.html) saying: [...] скопирую сюда, а то потеряется потом. оригинал: https://aridmoors.livejournal.com/709175.html [...]

Date: 2021-01-10 08:03 am (UTC)
From: [identity profile] vishniakov.livejournal.com
Так а разве не окажется так, что точно такой же пик на плавильный кривой будет у какой-то другой ДНК или РНК?
Если шаг 0.01 градус - то мы имеем всего несколько сотен различных положений пика для вообще всех ДНК и РНК в мире.
По идее, на каждый 0.01 градус будет приходится несколько различных.

Date: 2021-01-10 08:34 am (UTC)
From: [identity profile] melnikovvv.livejournal.com

Так это зависит от длины фрагмента и его состава.

Date: 2021-01-10 08:36 am (UTC)
From: [identity profile] vishniakov.livejournal.com
Ну так вот - как много разных длин фрагментов разных составов дадут пик ровно в том месте, где его дает ковид?

Date: 2021-01-10 08:58 am (UTC)
From: [identity profile] dobryiadmin.livejournal.com
Да, тоже интересно, что там с ошибками второго рода.

Date: 2021-01-10 09:00 am (UTC)
From: [identity profile] levgilman.livejournal.com
Обнаружили ковид в Канаде в старом, до эпидемии, образце. И - по общей методике. Насколько я понимаю, даже это отсеквенировать не удосужились. Ссылки не имею, я такие вещи не собираю.

Date: 2021-01-10 09:05 am (UTC)
From: [identity profile] levgilman.livejournal.com
Надо бы получать один стрэнд, а второй добавлять эталонный. Вот тогда будет видно, ковид это или что-то чуть похожее по праймерам подцепили. Заодно это и мутации проверяемого участка помогло бы отслеживать, в генеалогических целях.

Date: 2021-01-10 09:28 am (UTC)
From: [identity profile] p2004r.livejournal.com
Там ведь эталон кладут? (причем 2 даже, + и -)

По хорошему должны бочку эталона набодяжить загодя (чтоб на всю партию произведенную хватило) производители и класть разведения из него в каждую расслаемую. Ну и самим тоже смотреть немного на каких разведениях (привет гомеопатия :))) ) ломается методика.

Date: 2021-01-10 09:39 am (UTC)
From: [identity profile] Ольга Кривова (from livejournal.com)
Определенно надо оформлять статью. Успехов!

Date: 2021-01-10 10:02 am (UTC)
alex_dragon: (Default)
From: [personal profile] alex_dragon
С языка сняли. Только автор пишет словами о десятых градуса, то есть цифрами надо писать 0,1. А это тогда всего сто вариантов на десяток градусов.

Date: 2021-01-10 10:09 am (UTC)
From: [identity profile] alex-dvorak.livejournal.com
Читать было интересно, невзирая на то, что ни разу не специалист в медицине - биологии - биохимии (и даже на дилетанта не тяну).
Но немного разбираюсь в математике. В том числе, в методах статистики.
При желании, статистика - "сверхбольшая ложь" , а при желании - весьма информативная и сверхполезная вещь. Как любая вещь, имеющая "двойное назначение". В зависимости от цели применения.

Что я понял (возможно, что неправильно):
При одном и том же (однократном) прогоне ПЦР-теста на ковид на ПЦР-машине получается одна амплификационная кривая и одна плавильная. Так?
Почему-то бинарный ответ (есть ковид - нету ковида) получают из анализа амплификационной кривой (назовём это "анализом" :-) ), а не плавильной. Так?
Хотя по второй кривой можно судить с гораздо меньшей вероятностью ошибки. Так?

Если "всё так", то можно написать много конспирологии на тему "почему и зачем делают именно так", а можно от этого абстрагироваться и сухо написать статью-инструкцию "как надо делать". Надеюсь, Вы пойдете по второму пути.

Date: 2021-01-10 10:15 am (UTC)
alex_dragon: (Default)
From: [personal profile] alex_dragon
Короче, а нас, профанов, имеют как лохов. Вот знакомая чем-то заболела, переполошилась, сдала на тест на ковидлу. А он в наших степях где-то в районе полутора тысяч гривен стоит (около пятидесяти долларов). Чтоб было понятнее, три тысячи — это ещё не самая плохая пенсия, люди и меньше получают; официальная минимальная зарплата — пять тысяч. Ну так вот за эти деньги получает она красивый бланк с какими-то зюквами, из которых простонародье вроде нас может понять только что некая пороговая цифра определена как 0.4 попугая, а у неё насчитали 0.34 попугая. Формально вроде как ниже порогового значения. А по существу — издевательство, потому что каждый, кто имел дело хоть с какими-нибудь измерениями хоть чего-нибудь, понимает, что значения около пороговых — они всегда под вопросом. И вот за что она заплатила? Хрен его знает. Зато множество людей поимело себе икорку на бутербродик.

Date: 2021-01-10 10:21 am (UTC)
From: [identity profile] olezhek.livejournal.com
Melting curve анализ рутинно используется во многих тест системах как уточняющая методика. В том числе в тестах на ковид.

Про стрррашную ковидлу

Date: 2021-01-10 10:30 am (UTC)
From: [identity profile] livejournal.livejournal.com
User [livejournal.com profile] tawneee referenced to your post from Про стрррашную ковидлу (https://tawneee.livejournal.com/128908.html) saying: [...] что за 11 месяцев истерики многие поняли интуитивно: https://aridmoors.livejournal.com/709175.html [...]

Date: 2021-01-10 10:59 am (UTC)
From: [identity profile] science-ru-net.livejournal.com
Вместо КВАНТИФИКАЦИОННОГО ПЦР более по-русски будет "количественная ПЦР", по-видимому (или ПЦР в реальном времени).

Как Вы считаете, может ли быть петлевая изотермическая амплификация (https://en.wikipedia.org/wiki/Loop-mediated_isothermal_amplification) лишена недостатков количественной ПЦР для диагностики КОВИД?

Там по крайней мере нельзя сжульничать с количеством циклов (когда, если нужно нагнетать ужас - делаем всем 45 циклов, а если нужно голосовать за конституцию и проводить парад - делаем всем 25 циклов, например).

Date: 2021-01-10 12:03 pm (UTC)
From: [identity profile] aridmoors.livejournal.com
Так в том то и дело, что если гоняется только одна пара праймеров, то ты либо попадаешь в пик, либо нет. Вероятность, что что то другое будет иметь ту же плавильную температуру, мизерная.

Date: 2021-01-10 12:06 pm (UTC)
From: [identity profile] aridmoors.livejournal.com
"Используется" это очень широкое утверждение. Ты видел, как технишены реально каждую кривую проверяют? А ведь с тысячами образцов там будет на машине черти что. И что? Они типа "смотрят" на кривые? Не смеши мои тапочки. То, что делается, это они берут тарелку, скорее всегт даже не на девяносто шесть, а на триста с чем то, и тупо собирают Ст, и все. Не смеши меня, что они каждлый образец отдельно смотрят по плавильным кривым.

Date: 2021-01-10 12:14 pm (UTC)
From: [identity profile] aridmoors.livejournal.com
Вообще, твой коммент показывает, что ты сам либо никогда не делал купцр, либо делал крайне мало и только по уже известным праймерам. Любой человек, который глубоко работал с этим, никогда бы не написал такое "покрывальное" утвреждение, что "мелтинг керв анализ используется как уточняющая методика". Жто предложение из учебника, и только человек, который реально не представляет себе ЧО это значит, проверять каждый образец по плавильным кривым, может такое сказать.

В этом и проблема. Что большинство вот как ты, просто тупо не представляют, о чем они говорят. Ты хоть видел, как выглядят плавильные кривые в нетривиальных случаях?

Date: 2021-01-10 12:21 pm (UTC)
From: [identity profile] xoxlobandera.livejournal.com
Праймеры - это образцы?
А откуда вообще берется образец, например для ковида? Я имею ввиду, чем доказывается уникальность выбранной последовательности? Ведь количество всяких вирусов оценивается в десятки миллионов, а описано несколько тысяч. Откуда уверенность, что выбранная последовательность не совпадает с последовательностью какого-нибудь не описанного вируса/ов?
Page 1 of 6 << [1] [2] [3] [4] [5] [6] >>

Profile

aridmoors: (Default)
aridmoors

January 2026

S M T W T F S
    123
45678910
11121314151617
18192021222324
25262728293031

Style Credit

Expand Cut Tags

No cut tags
Page generated Jan. 20th, 2026 02:27 pm
Powered by Dreamwidth Studios