техническое

[aridmoors]

Я наверное тупица. Вы когда-нибудь работали с математикой?

Вот я читаю чужую статью в уважаемом журнале (Nature Scientific Reports, кстати), и там черным по белому написано: "мы определили эффективность праймеров для ПЦР реакции, которая варьировалась между 90.3% and 114.5%".

Я тупая, да? Как эффективность праймера, участвующего в реакции, которая заключается в физическом производстве копий молекул, может ДАЖЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИ быть более 100%? Ну это как вообще? Вот в физическом смысле, ЭТО ЧО? Это как? Т.е. ваши праймеры создали дублей, и в растворе эти дубли глядели на то как работает оригинал, и на коленке собирали за ним молекулу ДНК из подручно-плавающих материалов что ли? Что это такое вообще - эффективность праймера 114,5%? Праймер перевыполнил план блин? Как можно такое написать? Я осел и ничего не понимаю в жизни, да?

Нет, вы мне скажите, а то я умру! Что это за белиберда-то ну в самом деле. Какой смысл тогда вообще в ихней этой "оценке эффективности праймеров", когда они пишут 114%, - тогда можно написать и 150%, и 200%, и 1000%, да? Праймер у меня супер-эффективный мама дорогая, создает ДНК из ничего со скоростью света вопреки законам физики, так что ли?

Comments

[pukkallo.livejournal.com]

В данном случае я не в теме и, судя по Вашему описанию, ошибка однозначно. Однако, по близким мне областям возможно, что (1) они что-то взяли за базу и потом эту базу где-то протеряли или (2) этот праймер произвел копии "не тех" молекул, которые были посчитаны, как "те" (т.е. больше - это тоже вариант ошибки). Кстати, первая причина в технических публикациях случается регулярно :)

[aridmoors.livejournal.com]

Спасибо, буду иметь в виду. Сейчас сяду разбираться, откуда 114 взялось, они это сознательно или случайно, или у них вообще ход мыслей такой и вроде как так и надо.

[haladdin.livejournal.com]

Математика тут не при чем жеж.
Все зависит от того, что принимать за 100%.

[aridmoors.livejournal.com]

Вот и я спрашиваю: какой физический смысл в том, чтобы утверждать, что прймер эффективен на 114 процентов? Что у них 100 процентов в этом случае? Мне как-то всегда казалось, что это словосочетание - "эффективность праймера" - было введено именно для того, чтобы как-то бороться с тем фактом, что некоторые праймеры ПЛОХО цепляют ДНК и потому умножают ее не как следует, т.е. меньше.

Ну вот у нас есть в растворе цепочка ДНК, плавает, да? Ее надо умножать, копировать, т.е. наделать еще таких же одинаковых цепочек. Для копирования нам требуются праймеры. Они цепляются к ДНК по краям, и тогда можно эту цепочку достроить, т.е. создать копию. Копирование (естественно) может происходить только поштучно - ну это физические объекты, они либо есть, либо нет. То есть если у нас этот процесс будет идти идеально, мы, как и в случае размножения клеток, всегда будем получать ровно в два раза больше цепочек ДНК, чем в предыдущий раз. Ну когда клетка делится на две - то она всегда делится на две, там не может быть три, пять и т.д.
Вот и с праймерами. Нельзя достроить три, пять копий ДНК на имеющейся цепочке, это химически невозможно просто. Поэтому существует МАКСИМАЛЬНО возможное число копий, которое можно получить, если праймер будет работать и прицепляться к ДНК идеально.
И мне всегда казалось, что это и есть 100%!!!!!!!! Как у них могло получиться 114 - это выше моего понимания. Что это такое означает. Для меня это звучит как "но некоторые клетки в нашей тарелке ухитрились поделиться и на три!!!!! И выдали 114 процентов эфэективности деления!"

[haladdin.livejournal.com]

Хих =) Ну да, звучит диковато.
Но область не моя совсем, трудно сказать чем руководствовались авторы. В моей области или смежных такое бывает, как, например, любимый вопрос на защитах дипломов "может ли коэффициент уплотнения грунта быть больше единицы". И он таки может, потому что коэффициент уплотнения считается как отношение плотности достигнутой на стройплощадке к "максимальной", полученной в приборе стандартного уплотнения по ГОСТ. И тут весь фокус в том что это именно "максимальная" плотность для прибора, а не физически максимальная.

Ну или еще конденсационные котлы, например. Производители наперебой пишут что в них КПД больше 100%, некоторые менеджеры-недоучки даже берут эту идею на знамя и идут громить традиционную физику хих =)
Правда они не в курсе про разные методы подсчета КПД для котлов и различные условности, которые когда-то приняли для упрощения расчетов, заботясь о плохо развитом сером веществе как раз этих менеджеров-недоучек =)

[aridmoors.livejournal.com]

Во, спасибо за интересный комментарий! Про коэффициент уплотнения грунта понравилось.

Да, видимо с эффективностью праймеров тут тоже что-то такое. Что-то посчитали, но плохо поняли, что именно. Хотя с коэффициентом уплотнения все-таки легче: его хотя бы не называют "эффективностью уплотнения". Коэффициент - это хотя бы понятно, что цифра, на чем-то построенная. А с праймерами так и ляпают: эффективность.

[haladdin.livejournal.com]

Ну, кстати, с уплотнением грунтов тоже иногда вводят "эффективность уплотнения" =)
Как правило, это "пиар-величина", для красивого отчета, например. Определяют ее еще смешней: как отношение достигнутого коэффициента уплотнения к требуемому по проекту. Сплошь и рядом получается больше 100% =)

GIGO

[nil-0.livejournal.com]

Цепляние праймера к ДНК - случайный процесс. Праймер и ДНК должны столкнуться в результате броуновского движения и слипнуться. Что такое 100% здесь не очень понятно. Какой бы замечательный ни был праймер, если он столкнулся с ДНК в положении "верх ногами", он скорее всего не зацепится. Подозреваю, что после дупликации праймеру надо ещё и отцепиться. Если он намертво прилип и отлипать не хочет, то это тоже должно снижать эффективность, т.к. отлепившись он мог бы обработать следующую цепочку ДНК. Так что тут вопросы возникают как в ТВ-рекламе: "ресницы стали на 300% гуще - объясните что вы вообще измеряли".

В общем, методология - наше всё. Если "эффективность праймера" не является общепризнанным термином со стандартными методами измерения, то в статье должно быть описание метода измерения, или ссылка на такое описание в литературе. Если условие не выполнено, то можно статью сразу в корзину. Ну, если сразу в корзину не хочется, то написать авторам и спросить про определения и методику измерения.

Математика тут не при чём. См. "Garbage In, Garbage Out"
https://ru.wikipedia.org/wiki/GIGO

Re: GIGO

[aridmoors.livejournal.com]

Аааааа, про ресницы на 300% гуще:)))))))))))))))))))))

[sciuro.livejournal.com]

https://splice-bio.com/amplification-efficiency-exceeds-100-how-is-that-possible/
Вот тут на пальцах объясняется, как оно возникает. Часто встречается.
Насколько я помню, до 120% cчитается ок, выше уже нехорошо. Но я сто лет не ставила пцры, не помню уже точно :)

Вообще, с такими вопросами очень хорошо искать ответы на researchgate, обычно там они уже задавались не раз (про эту тему, например, тут же три обсуждения вываливаются: https://www.google.com/search?q=primer+efficiency+over+100+site%3Aresearchgate.net&oq=primer+efficiency+over+100+site%3Aresearchgate.net), и можно свой собственный с легкостью задать :)

[aridmoors.livejournal.com]

Спасибо! Понятно.
Т.е. получается, что они делают эту линию тренда ко концентрациям, а потом считают наклон этой кривой, при этом, естественно, рутинно получается, что более концентрированные сэмплы умножаются хуже, чем менее концентрированные, а какая там реально эффективность - это вообще непонятно (в смысле они не ее считают, они по сути считают зависимость Сt от концентрации, другими словами зависимость того, насколько быстро машина поймает флуоресцентный сигнал в зависимости от станртовой концентрации на именно этой ДНК с именно этими праймерами). Непонятно, почему они это приравнивают к эффективности праймера. Это не эффективность праймера, хотя она и может влиять на полученные Ct.

Или я че-то не так поняла?

[darkhon.livejournal.com]

Похоже, что кто-то с мыщлением менеджера ввёл термин "эффективность" по привычке, а дальше такие же обрадовались и продолжили :-)

[scholarpunk.livejournal.com]

Ну дык запутина ващпэ 146% порою голосуют, и ничо!..

И Вы какбутто не с Советском Союзе родились, не зная что в военное время синус порою может доходить до двух...

[aridmoors.livejournal.com]

Полезла посмотреть. Нашла много еще чего интересного, что можно сказать про таких ученых.
"Копаетесь, как свинья в апельсинах, не знаете, где край, а где конец !"))))) Эт точно, это про них и эти несчастные ПЦР-реакции:)))

[gray-bird.livejournal.com]

Я бы понял , что есть некие "естественные условия", которые принимаем за 100%, а потом пересчитываем эффективность с учетом добавленного фактора.
Как например химическая реакция в присутствии катализатора идет в тысячи раз эффективней чем без.

[meloco-go.livejournal.com]

Далек от этого, но любопытство взяло. В общем формула PCR efficiency=(10^[−1/slope] − 1) × 100 дает сотню при странном значении наклона -1/lg(2). Это, конечно, весьма занятно, считать в процентах величину, которая по своему смыслу не является долей чего-то. Но я совершенно не понял, что это за наклон, почему он отрицательный, и что за волшебная константа такая это самое -1/lg(2).
Ссылки вроде ведут к http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X03025646
Может есть что-то более раннее?

[aridmoors.livejournal.com]

да-да-да, они все на это ссылаются! я еще не разобралась, это начало или есть что-то ранее чем это. может быть, это самое раннее, вроде как сама реакция была выдумана году в 1980-каком-то.

Про логарифм по два - это, мне кажется, и есть умножение ДНК на два, т.е. ее удвоение, которое должно происходить при идеальной реакции. Ведь даже, я же правильно понимаю?

[meloco-go.livejournal.com]

>Про логарифм по два - это, мне кажется, и есть умножение ДНК на два, т.е. ее удвоение, которое должно происходить при идеальной реакции. Ведь даже, я же правильно понимаю?
Вот тут, выходит, что так: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/appendix/pcr_rtpcr/important%20parameters%20of%20qpcr.pdf
Но, как я понял, находят этот самый наклон из графика зависимости порогового значения количества циклов ПЦР от количества реагента. Т.е. 100% эффективность, это в два раза увеличили количество реагента, в 1/log(2) раза сократилось число циклов.
При этом, пороговое значение определяется б.менее на глаз из вот таких кривых флуоресценции, https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/pcr-understanding-ct-application-note.html
Так что, ничего удивительного, если где-то вышло больше 100% нет. Удивительно, что считают это в процентах. Ну, видимо, людям как-то понятнее.
А вообще, вы интересную тему подняли. Протоколы они, конечно, благо, но усыпляют разум. А там и до чудовищ недалеко.

[aridmoors.livejournal.com]

///Т.е. 100% эффективность, это в два раза увеличили количество реагента, в 1/log(2) раза сократилось число циклов.
Вот, да, вы очень понятно сказали.
Пороговое значение обычно определяет машина, которая делает ПЦР, и она в общем его достаточно стабильно определяет, я обычно когда кривые смотрю, у меня не возникает желает что-то поправить, и в общем и графики тоже получаются достаточно красивые.

Я вот сейчас думаю, почему же все-таки тогда наклон этих кривых получается разный, и почему возникают 114 процентов. Что является источником этих багов. Они утверждают, мол, засорение сэмплов посторонними веществами, которые ухудшают качество реакции. Вы вот выдвинули версию, что раз порог определяется на глаз, то может быть это порог. Но у меня ощущение, что это ни то, ни другое, но поскольку я руками такие кривые никогда не строила (руками конкретно такой эксперимент никогда не гоняла, не получала 114 процентов), то мне сложно понять, откуда растут ноги.

Пойти прогнать что ли. Только надо придумать, как сделать так, чтобы изолировать этот фактор, который дает баг. Как поставить эксперимент? У меня вариант: баг может возникать на этапе
1) Собственно реакции - как они предлагают, засорения реакции мусором
2) Проставления порога машиной
3) Заполнения реакционной кюветы человеком, который вынужден руками пипетировать микролитры
4) Разведения ДНК до этих концентраций, которая опять же выполняется человеком, вынужденным пипетировать микролитры

Вот мне все-таки кажется, что первые два менее вероятны, чем вторые два. А то у них в этих мануалах само собой разумеется, что человек ошибку сделать не может, мол они-то все правильно развели и напипетировали, это все засорение! Это оно дает ошибку. Че-то мне кажется все наоборот должно быть. Баг возникает, потому что когда люди этот эксперимент делают и разводят ДНК для него, у них там-сям плюс-минус пару десятков нанограм получается запросто. А вот машина-то как раз эти нанограмы ловит как следует, качественно, вот она их и отражает.

Как все-таки эксперимент задизайнить, чтобы эти факторы изолировать?..

[meloco-go.livejournal.com]

Да, неполное разбавление (думаем, что в 2 раза, по факту 1,9) может дать подобное поведение. Но шкала логарифмическая, нужно довольно сильно ошибиться, впрочем, все возможно. И разбавление весьма чувствительная процедура -- диффузия штука довольно медленная, так что бултыхать надо интенсивно, но аккуратно и без спешки, а то у меня как-то отрицательные константы связывания получили.
По поводу дизайна:
1) можно добавить ингибитора, правда, нужно еще количество подобрать, чтобы проявился соответствующий эффект.
2-4) вещи стохастические. Брать несколько человек (чтобы каждый делал по-своему), вооружить разными пипетками и т.д. Отделить 2 от 3-4 можно, если сливать данные и проверять вручную.
Но это все время и ресурсы, и вкусную статью не сделаешь, к сожалению, хотя я бы такие работы поощрял. Недавно видел похожие доклады, по другой теме совсем, но идея -- проверить методические моменты. Результаты ожидаемые, но нмв важно своими глазами увидеть.

[borzja.livejournal.com]

Вот оно - чудо творения!