суровые рабочие будни

[aridmoors]

Вот кто там хотел чтоб ему объяснили чем красить ткани сложнее, чем клетки?

Еще один пост того, как выглядит что-нибудь неработающее.



Во-первых, сначала я попыталась покрасить согласно протоколу с инкубацией ночью, и наутро у меня всё высохло. Но тем не менее у меня получилась вполне красивая картинка. И это слава богу, что я знаю что я крашу! Я крашу ацетилированный тубулин. И такой картинки просто не может быть! А так всё круто, сигнал сильный, обалдеть.
Так вот: а если ты НЕ ЗНАЕШЬ, как должно выглядеть то, что ты красишь? Как ты отличишь ерунду от не ерунды?



Ну я сколотила из подручных материалов влажную посудину, покрасила еще раз. На этот раз картинка получилась куда более осмысленной, какой-то нормальный рисунок начал проступать. Вот это уже похоже на реальный сигнал антитела.



Увеличиваем разрешение и получаем:



Центросомы! Это е..чие центросомы! Зуб даю, центросомы.
А теперь объясните мне, с какого перепугу ацетилированный тубулин ВНЕЗАПНО показывает центросомы? Не то чтобы это прямо вот не может быть - все-таки центросомы состоят из тубулина. Но! Он должен показывать силии! Он и показывает силии - в клеточной культуре. На этих же самых клетках (эндокринных), только клеточной линии. Там это тело (прям из той же пробирки) работает на ура! Вон какие штуки показывает, прямо как полагается:



И как, КАК объяснить, что в тканях это же самое тело внезапно показывает центросомы??

Или как например объяснить вот эту картинку покраски DAPI на этом же образце? Это ЧО ВАЩЕ?



И ответом мне только гробовое молчание да японский ветер, гулко бродящий по темным ночным коридорам.

Comments

[vvz.livejournal.com]

Ну вы, блин, даёте! Но как?!

[seraph-almighty.livejournal.com]

Интересная у вас там жизнь. Мало вам, что вы в Японии, так еще и клетки красите )

[marin-mulier.livejournal.com]

Интересно заниматься исследованиями. Совершить какое-нибудь важное открытие.
Для простых людей это как волшебство. Странно, непонятно, но интересно. И вообще, иногда даже страшновато - что там еще за гранью наших знаний?

[schizophrenicat.livejournal.com]

Всегда интересно подсмотреть, как работают в других лабораториях. А что это? Флюоресцентные метки? Там методика типа иммунохимии? Увидела знакомое слово "антитело", стало еще любопытнее))
Может быть, разница в окрашивании связана со свойствами клеток, а может, надо методику отработать; но чтобы сказать точно, надо посоветоваться с кем-то знающим...

[aridmoors.livejournal.com]

В нашем учреждении я и есть кто-то знающий:)
Это иммуногистохимия. Почему так - может быть несколько вариантов. Первое, что приходит на ум - это я взяла чей-то triton. У меня свой кончился, я схватила со стола чей-то чужой, на нем было написано что он 0.5%, но это не факт, что он действительно 0.5%. Мало ли кто там как разводил. А я положила на всю ночь. Иногда бывает, что от сильного трайтона силии рассасываются, и тогда остается только основание (т.е. центросома) - вот я их и вижу.
Впрочем, это не объясняет, почему покрашены ВСЕ центросомы, если бы было именно рассасывание силий, то видна была бы только одна центросома, а вторая (парная) видна быть не должна.

Второй вариант - это что виновата покраска mouse-on-mouse. Я использовала мышиное антитело на мышиных тканях. Антитела, как известно, species-specific, в смысле реагируют на какие-то виды животных. Покраска мышиного мышиным - это известная проблема в биологии, все с ней трахаются. Каких уже только растворов не изобрели для преодоления этой проблемы, и все равно mouse-on-mouse плохо работает в большинстве случаев. Впрочем, там должен был быть большой бэкраунд, в смысле большой посторонний сигнал, как на первой фотке, а у меня как раз избирательно центросомы - то есть нуууу... не знаю, насколько это объяснение годится.

Блин, ну это сайенс фикшн какой-то, КАК может антитело помечать силии в культуре и центросомы в тканях. Черт, я не могу, я щас пойду еще раз повторю, я так не усну сегодня, ну блин ну НЕ МОЖЕТ БЫТЬ этого блин.
Заодно с еще одним антителом повторю, у меня второе есть, кроликовое. Что за черт-то блин.

[schizophrenicat.livejournal.com]

ооо, ИГХ - то, чем я занимаюсь, только у нас диагностика in vitro, другая методика (высокотемпературная демаскировка, окраска DAB, всё это в автостейнере, хотя приходилось делать и вручную - в условиях нехватки реагентов и от безысходности). Интересно узнать, как иммуногистохимические методы применяются не только для диагностики, но и для научных исследований.
На фоновое окрашивание явно не похоже, может, такая окраска - особенность конкретного антитела? Клон другой или что-то еще... Напрашивается вывод, что где-то нестыковка в методике. Трайтон - это для демаскировки? Он мог действительно "отожрать лишнего" или демаскировать не то. Но у нас при неподходящей демаскировке обычно получается специфическое, но слабое окрашивание (или его вообще нет). Странное окрашивание (например, панцитокератин выкрасил эндотелий и т. п.) и неспецифику обычно давали либо слишком активные и концентрированные антитела, либо просроченный HRP-полимер. Кгда у нас что-то не получается, мы обычно либо концентрацию/время инкубации антитела меняем, либо колдуем с демаскировкой.
Обязательно надо повторить, лично проконтролировав все этапы, желательно с контрольным образцом!

суровые рабочие будни

[livejournal.livejournal.com]

User molchun22ru referenced to your post from суровые рабочие будни (http://molchun22ru.livejournal.com/307793.html) saying: [...] Оригинал взят у в суровые рабочие будни [...]

[vadperez.livejournal.com]

первый вопрос, конечно же - как ткань получена.
0.5% всю ночь? ядер нет, а сигнала нет, значит там адерная мембрана того...
и да, если это парафиновый срез - там будет сильная автофлюоресценсция на всех цветах. Срез, кстати, (10х-20х?) выглядит высохшим... что за среда включения?

[aridmoors.livejournal.com]

Это OCT срез 10.3.
В Цюрихе я оставляла с 0.5% на всю ночь абсолютно без проблем. Оставались и ядра и силии. Не думаю, что ядерная мембрана того, я думаю какой-то косяк с DAPI. Кроме того, контуры клеток вполне нормальные, центросомы на правильных местах.

Да, от парафина сильная аутофлуоресценция бывает, впрочем от ОСТ тоже. Она хорошо погасилась CAS-block-ом в этот раз. Высохший - вот это да, это может быть((( У меня криостат на суита-кампусе, а оттуда надо переть сэмплы до нас((( в лед их что ли складывать? Но где там лед держать, да и где столько сухого льда найти, чтоб каждый раз таскать... высохнуть могли запросто. Там еще когда сидишь и режешь, в помещении почему-то жарища и дует кондиционер, который никак не выключается. Не знаю что и придумать. Куда их совать-то...

[vadperez.livejournal.com]

что такое ост 10.3 (10 микрон на криотоме? - жестко на всю ночь в 0.5%...
а, видимо да.
если такие траблы, и срезы небольшие, я б наверно их сразу в холодный PBS+4%PFA (на водяном льду) и кистью потом расправил бы на стекле.

[aridmoors.livejournal.com]

Фиксить сразу... да, наверное это вариант. Спасибо. Попробую еще раз, посмотрю что получится по обстоятельствам.

Слушайте блин, вот сегодня у меня с утра удар хуже некуда. Я выяснила наконец почему у меня клонинг не получался. Я уже думала-думала на всё что угодно, и тут наконец дошла до самого начала (т.е. размножения начального вектора в бактериях) и посадила все контролы какие могла! Блин!!! На наших проклятых ампицилиновых тарелках ВЫРОСЛИ КОМПЕТЕНТНЫЕ КЛЕТКИ БЕЗ НИЧЕГО!!!
Убила бы. Вот теперь ходи выясняй кто сделал эхти тарелки и в каком году, и что это за компетентные клетки.

Блин, всё всегда делай сам. Ааааа, хочу свою лабу. В Киото у нас так не было, там жестко контролировали качество common stocks. Хотя там и база всегда была правильная, любой эксперимент всегда имеет все контролы, а я тут расслабилась, думала ну не могут же у нас фигню делать, если тарелки стоят - значит они качественные... ага, щас.

[vadperez.livejournal.com]

сходите к Длинному, наверняка есть ампицилиновые тарелки (если очень припирает).
Мы делали пробный сев, правда на стоках компетентных бактерий. Чашки обычно не проверяли. Но у нас обычно парами занимались лаб дютиз. Один пашет, другой руками машет

[aridmoors.livejournal.com]

Скорее всего кто-то забыл положил антибиотики, когда разливал. Тарелки сама сделаю, так быстрее - не могу же я к Длинному за тарелками внезапно вот так прийти))

[vadperez.livejournal.com]

через сенсея можно)) если соберетесь, передавайте привет))

[aridmoors.livejournal.com]

Сделала тарелки сама. Всё нормально выросло, как положено. Вот возьму и никому не скажу что там тарелки плохие. Пусть мучаются! Хы.

[vadperez.livejournal.com]

я вот было со злости хотел свои стоки плазмид перед отъездом перемешать.
потом плюнул и подписал их нормально.
А недавно они мне понадобились и мне прислали их по эмс. а вот если бы...
короче, грабли себе не того...

[aridmoors.livejournal.com]

Что такое среда включения?

[vadperez.livejournal.com]

выпендрился))
mounting medium, то бишь. Vectashield?

[aridmoors.livejournal.com]

А, да, векташилд. Может я неправильно сделала, что туда добавила дапи? Я раньше всегда только хёкст добавляла в векташилд. Может дапи туда нельзя? Вы пробовали?

[vadperez.livejournal.com]

продается дапи-векта.
но у меня была проблема когда я делал сток дапи в пбс - там осадочек выпадал, дапи фосфаты чувствует. если были остатки пбс на препарате могло осесть (хотя по идее разведение дапи для покраски должно быть достаточно сильным).
в любом случае, я предпочитаю окраску отдельно, маунтить - отдельно.
либо дапи-векта и оставить на недельку в холодильнике, чтобы лишнего красителя где ни попадя не болталось.

[aridmoors.livejournal.com]

Вот да, пбс там был. Могло осесть, и оно похоже на как будто осело. Какие-то разводы мутные на картинке.

Ладно, спасибо, попробую хёкстом.

[vadperez.livejournal.com]

если зафиксировано пфа промойте срезы просто миликю (без фанатизма).

[aridmoors.livejournal.com]

Слушайте, большое спасибо за совет с дапи и пбс, это действительно кажется был осадок. Я промыла вожой перед покраской, и все хорошо покрасилось. Я с дапи не много работала, и такого не знала.

А вот с центросомами... хьюстон, у нас проблема. Кажетццо это не антитело и не покраска и не техника виноваты. Кажеццо это наша мышш.
Срочно достаю wild type , кромсаю и проверяю. Че-то мне кажется я нашла причину, почему наши мыши имеют только 2-3 щенка за беременность. И если это так, то это блин проблема. Тут только это... молчать в тряпочку и ссылаться что эта мышь уже опубликована в нейчур. Я ничо не видела ничо не знаю.

[vadperez.livejournal.com]

но, насколько я понимаю, у Вас задача на цилии повязана? обязательно выскочит потом где-нибудь трабла. помните про год?

[aridmoors.livejournal.com]

Нет, задача на силиях не повязана. Но я понимаю, насколько это серьезное утверждение - во всех смыслах, так что я сначала еще раз проверю и перепроверю, что это именно мышь, а не антитело или не моя покраска. Потому что если это действительно мышь, последствия достаточно серьезные. Не только для меня, но и для тех, кто с этой мышью уже публиковался.

[vadperez.livejournal.com]

те же тарелки, в мировом масштабе..