про воспроизводимость
May. 15th, 2016 08:19 am![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
aridmoorsВчера ездила еще раз в свою старую лабу, поговорить про мой проект. Как ученый, я очень счастлива. Все мои данные, которые я получила, были повторены моим сенсеем без малейших отклонений (он готовит все это к печати и хотел снять картинки покруче - ну и доработать проект). Более того, там получилось так красиво, что мне хотелось заплакать от умиления. И показать это всем тем, кто утверждает, что "в науке ничо не воспроизводится, ничо не воспроизводится, никому верить нельзя". Я щас расскажу.
Тока там будет много деталей, наверно неинтересно никому, кроме биологов и химиков.
Детали. Можно пропустить и прочитать полный эмоций вывод в конце.
У меня был эксперимент с изучением ДНК-последовательностей, прицепленных к GFP (зеленый флуоресцентный протеин). То есть я брала этот зеленый протеин и цепляла к нему спереди разные мелкие последовательности. От этого этот протеин шел в какую-нибудь часть клетки. Например, в норме зеленый протеин находится в ядре и цитоплазме, вот так:
А если к нему добавить какую-нибудь последовательность, то он идет в какое-нибудь другое место в клетке, скажем в зеленые пузыри, например вот так (синее - это ядро):
(картинки из интернета)
А у меня получалось постоянно, что у меня этот протеин и в новом месте, и в старом. То есть он и в пузырях, и в ядре одновременно. Это было неприятно и не совпадало с тем, как оно все должно быть по идее. По идее если протеин в новом месте, то он и должен быть в новом. Полностью. А не так, что и там, и там. И когда я была в старой лабе, я так и не нашла точный и четкий ответ на вопрос, в чем дело. Мы обсуждали много раз, что может быть есть какие-то добавочные модификации, которые прицепляются к моим отрезкам, которые я вставляю, и может быть этот процесс не полностью эффективен, и тогда сколько-то процентов протеина окажется в ядре, а сколько-то в другом, новом месте...
Так вот, ответ на задачку оказался настолько прост и элегантен, что это было обалденно.
Я не убрала старт-кодон с зеленого протеина, когда прицепляла свои отрезки.
Ну все протеины начинаются со старта - ATG. Вообще это метионин (аминокислота), и она может быть в любом месте. Но в начале протеина она вообще всегда есть. Ну и когда я делала свои протеины, я рассуждала так: вот цепочка ДНК, которую я делаю, скажем
ATGcagtgagctacgatgctgATGtgacacgacta...
В начале - старт-кодон. С него начинается мой короткий отрезок (тут я его написала маленькими буквами). А следующий ATG - это начальный ATG зеленого флуоресцентного протеина. Ну и я рассуждала так. Дофига протеинов построены таким же образом. Они начинаются с метионина, продолжаются какими-нибудь другими кислотами и потом в середине у них бывает еще раз метионин, просто так. Как обычная аминокислота. И она не считывается машиной как "начало", потому что она не в начале.
Ну и я точно так же сделаю свой протеин. В начале у меня будет правильный стартовый ATG, потом будут какие-то другие кислоты, а потом этот ATG из-под зеленого протеина - это будет просто метионин, который там просто есть в качестве обычного метионина. И он не будет распознаваться как начало. Он же в середине.
Так вот, оказывается нифига. Оказывается все это время в моих клетках производилось два разных протеина! Один из них был длинный, с цепочкой в начале, и шел в пузыри. А второй был обычный зеленый флуоресцентный протеин, который машиной почему-то считывался со второго по счету ATG и вел себя как обычный зеленый флуоресцентный протеин! Сенсей четко показал, что если поменять хотя бы одну букву в этом втором ATG, то эффект исчезает. То есть второй ATG распознается как начало(sic!!).
(И вот тут-то блин, в процессе написания вот этого поста, прям щас, до меня доперло, до какой степени это все-таки странно)
(Собственно, а какого хрена? Вот если меня кто-нибудь из биологов читает, вот вы мне можете внятно объяснить, какого хрена ATG в середине считывается клеткой как начало протеина? Это что еще за выкрутасы, неизвестные науке? Собственно, где была ошибка в моих изначальных рассуждениях, что если ATG в середине, то он нихрена не должен быть распознаваем как начало? Вы разве не так же делаете свои конструкты? Вы когда-нибудь беспокоились, что у вас в плазмиде ATG где-нибудь в середине?
Вы понимаете, какие выводы из этого надо сделать? Это ведь означает, что либо это происходит ВЕЗДЕ, в смысле любые серединные ATG производят дефектные протеины, т.е. любой ATG распознается клеткой как старт, и потом надо исправлять всю эту нагенеренную косячную белиберду; либо клетка откуда-то знает, какие ATG правильные, а какие нет (а мне никаких подобных механизмов неизвестно - поправьте меня, если вы их знаете)).
----
Конец деталей.
Собственно, в качестве вывода, мне очень, очень хочется знать, из какого места растут руки у тех научных работников, которые приходили ко мне в жж и яростно доказывали, что вот даже у них в лабе ничего не воспроизводится. Что ой-ой-ой 80% того, что делается в науке, - этому нельзя верить, потому что бла-бла-бла ничего не работает.
Не знаю как у них - у меня все работает. Это притом, что я была криворукий начинающий недоучка. Все результаты, которые я сгенерила - все они были четко воспроизведены сенсеем. И на основе их даже найдена новая, вписывающаяся в идею информация. И я могу их повторить. И любой с нормальными руками и головой может их повторить. И работает это четко. Как в физике. По законам науки. Которые можно понять, сформулировать и использовать.
А если у кого-то там что-то не воспроизводится, то пусть он идет и учит матчасть.
Тока там будет много деталей, наверно неинтересно никому, кроме биологов и химиков.
Детали. Можно пропустить и прочитать полный эмоций вывод в конце.
У меня был эксперимент с изучением ДНК-последовательностей, прицепленных к GFP (зеленый флуоресцентный протеин). То есть я брала этот зеленый протеин и цепляла к нему спереди разные мелкие последовательности. От этого этот протеин шел в какую-нибудь часть клетки. Например, в норме зеленый протеин находится в ядре и цитоплазме, вот так:
А если к нему добавить какую-нибудь последовательность, то он идет в какое-нибудь другое место в клетке, скажем в зеленые пузыри, например вот так (синее - это ядро):
(картинки из интернета)
А у меня получалось постоянно, что у меня этот протеин и в новом месте, и в старом. То есть он и в пузырях, и в ядре одновременно. Это было неприятно и не совпадало с тем, как оно все должно быть по идее. По идее если протеин в новом месте, то он и должен быть в новом. Полностью. А не так, что и там, и там. И когда я была в старой лабе, я так и не нашла точный и четкий ответ на вопрос, в чем дело. Мы обсуждали много раз, что может быть есть какие-то добавочные модификации, которые прицепляются к моим отрезкам, которые я вставляю, и может быть этот процесс не полностью эффективен, и тогда сколько-то процентов протеина окажется в ядре, а сколько-то в другом, новом месте...
Так вот, ответ на задачку оказался настолько прост и элегантен, что это было обалденно.
Я не убрала старт-кодон с зеленого протеина, когда прицепляла свои отрезки.
Ну все протеины начинаются со старта - ATG. Вообще это метионин (аминокислота), и она может быть в любом месте. Но в начале протеина она вообще всегда есть. Ну и когда я делала свои протеины, я рассуждала так: вот цепочка ДНК, которую я делаю, скажем
ATGcagtgagctacgatgctgATGtgacacgacta...
В начале - старт-кодон. С него начинается мой короткий отрезок (тут я его написала маленькими буквами). А следующий ATG - это начальный ATG зеленого флуоресцентного протеина. Ну и я рассуждала так. Дофига протеинов построены таким же образом. Они начинаются с метионина, продолжаются какими-нибудь другими кислотами и потом в середине у них бывает еще раз метионин, просто так. Как обычная аминокислота. И она не считывается машиной как "начало", потому что она не в начале.
Ну и я точно так же сделаю свой протеин. В начале у меня будет правильный стартовый ATG, потом будут какие-то другие кислоты, а потом этот ATG из-под зеленого протеина - это будет просто метионин, который там просто есть в качестве обычного метионина. И он не будет распознаваться как начало. Он же в середине.
Так вот, оказывается нифига. Оказывается все это время в моих клетках производилось два разных протеина! Один из них был длинный, с цепочкой в начале, и шел в пузыри. А второй был обычный зеленый флуоресцентный протеин, который машиной почему-то считывался со второго по счету ATG и вел себя как обычный зеленый флуоресцентный протеин! Сенсей четко показал, что если поменять хотя бы одну букву в этом втором ATG, то эффект исчезает. То есть второй ATG распознается как начало(sic!!).
(И вот тут-то блин, в процессе написания вот этого поста, прям щас, до меня доперло, до какой степени это все-таки странно)
(Собственно, а какого хрена? Вот если меня кто-нибудь из биологов читает, вот вы мне можете внятно объяснить, какого хрена ATG в середине считывается клеткой как начало протеина? Это что еще за выкрутасы, неизвестные науке? Собственно, где была ошибка в моих изначальных рассуждениях, что если ATG в середине, то он нихрена не должен быть распознаваем как начало? Вы разве не так же делаете свои конструкты? Вы когда-нибудь беспокоились, что у вас в плазмиде ATG где-нибудь в середине?
Вы понимаете, какие выводы из этого надо сделать? Это ведь означает, что либо это происходит ВЕЗДЕ, в смысле любые серединные ATG производят дефектные протеины, т.е. любой ATG распознается клеткой как старт, и потом надо исправлять всю эту нагенеренную косячную белиберду; либо клетка откуда-то знает, какие ATG правильные, а какие нет (а мне никаких подобных механизмов неизвестно - поправьте меня, если вы их знаете)).
----
Конец деталей.
Собственно, в качестве вывода, мне очень, очень хочется знать, из какого места растут руки у тех научных работников, которые приходили ко мне в жж и яростно доказывали, что вот даже у них в лабе ничего не воспроизводится. Что ой-ой-ой 80% того, что делается в науке, - этому нельзя верить, потому что бла-бла-бла ничего не работает.
Не знаю как у них - у меня все работает. Это притом, что я была криворукий начинающий недоучка. Все результаты, которые я сгенерила - все они были четко воспроизведены сенсеем. И на основе их даже найдена новая, вписывающаяся в идею информация. И я могу их повторить. И любой с нормальными руками и головой может их повторить. И работает это четко. Как в физике. По законам науки. Которые можно понять, сформулировать и использовать.
А если у кого-то там что-то не воспроизводится, то пусть он идет и учит матчасть.
![[identity profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/openid.png){kind=small}
no subject
Date: 2016-05-15 12:37 am (UTC)no subject
Date: 2016-05-15 12:52 am (UTC)Мне кстати нравится, что можно вот так сразу найти статью по теме, которая действительно сходится с тем, что у меня в wetlab получается руками. Кто вообще после этого может говорить про невоспроизводимость, я не знаю.
no subject
Date: 2016-05-15 12:59 am (UTC)вроде мы еще факт наблюдали, но пожалуй приберегу для возможных студентов))) не буду пока палить))
no subject
Date: 2016-05-15 01:16 am (UTC)У нас этот феномен тоже отражался в вестерн-блотах, мы получали две полоски, одну размера GFP, а вторую чуть повыше. Это нас невероятно раздражало - полоски были обе там точно, и мы их даже количественно меряли, и нас бесило, что GFP больше, чем "GFP-с-хвостом". Это никак не укладывалось и было некрасиво. А потом вот когда сенсей нашел разгадку, это было просто обалденно.
Но у меня впечатление, что это не мейнстрим, что в учебниках пока про это не пишут (или я ошибаюсь)? Я с транскрипцией-трансляцией совсем не знакома. И меня интересует implications для создания плазмидов и особенно для создания трансгенных мышей. Там же сейчас все начнут ДНК делать руками (в смысле синтезировать и вставлять потом этими crispr-cas), вот где это знание надо чтоб было у каждого!
no subject
Date: 2016-05-15 01:18 am (UTC)no subject
Date: 2016-05-15 01:21 am (UTC)Там правда написано To determine the best possible option for your research project contact us at: +1 877 3... or info@DNA20
Или это не тот сайт?
no subject
Date: 2016-05-15 01:44 am (UTC)честно говоря, я не работал с криспр-кас и как-то не следил за этой темой.
но может crispr.mit.edu ? вот тут его цитируют ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4265475/
компаний сейчас много... genecopoeia.ком taconic.ком
bmcbiotechnol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12896-016-0234-4
а точно нельзя просто этих мышей купить? поучиться их создавать - это классно, но это - время...
no subject
Date: 2016-05-15 06:50 am (UTC)no subject
Date: 2016-05-15 01:00 am (UTC)no subject
Date: 2016-05-15 01:18 am (UTC)no subject
Date: 2016-05-15 01:23 am (UTC)no subject
Date: 2016-05-15 01:29 am (UTC)По-моему это очень прикольно, куда все это двигается. Все начнают осознавать, что надо, во-первых, четко измерять и собирать статистику по популяциям, а во-вторых, что надо эти колебания внутри популяций клеток как-то ловить (т.е. думать над тем, как все внешние факторы могут влиять на исход, вплоть до температуры и влажности в комнате, где клетки пересаживаются).
no subject
Date: 2016-05-15 01:48 am (UTC)а че, все привыкли что клетки если не показывают Са2+ рилиз значит ничего не чувствуют)) а механочувствительность никто не отменял) и она вполне может быть не повязана на кальции кроме специфических случаев с Piezo, который не во всех клетках экспрессируется)
Subject: Инициация трансляции и все-все-все Альтернативны
Date: 2016-05-15 12:33 pm (UTC)Насчёт свободного магния - да, востпроизводимо мерять концентрацию не получается. И, кстати, магний - ещё один регулятор инициации трансляции :)
no subject
Date: 2016-05-15 05:31 am (UTC)немного айтишник, немного техник безопасности (слаботочник, кто знает, тот поймёт)
безумно интересно всё. и про японию. и про биологию.
единственный журнал, у которого на 100% всегда и полностью читаю комментарии. :)
no subject
Date: 2016-05-15 07:26 am (UTC)вот это "старт-код" сразу провоцирует много ассемблерно-подобных мыслей)))
no subject
Date: 2016-05-15 06:21 am (UTC)Может вам какой-нибудь язык программирования освоить на уровне базового синтаксиса - а ну как выяснится, что там в ДНК вообще ассемблер и разумный дизаен!
no subject
Date: 2016-05-15 07:02 am (UTC)no subject
Date: 2016-05-15 06:36 am (UTC)Погуглил слегка Козака,про consensus sequence. Чего сразу нашел
Date: 2016-05-15 07:10 am (UTC)-------------------------------------------------------------------------------------------------
ПРАВИЛА ПОВЕДЕНИЯ КОЗАКА В ХРАМЕ БОЖЬЕМ
(Козацька церква)
Козака воспитывали так, что храм — это святое место.
Козак в храме Божием вел себя именно так:
1. По дороге в храм повторяй молитву Иисусову: «Господи Иисусе Христе, Сыне Божий, помилуй мя грешного».
2. Заходи в храм, ища мира, успокоения и очищения души твоей.
3. В храме по обычаю казаки должны стоять в правой стороне, а казачки — в левой.
4. В храм надо приходить в парадной форме, головной убор снят и находится в левой руке. Казачкам следует быть с покрытой головой, с не окрашенными губами, в юбке приличной длины.
5. Козак всегда должен носить на себе нательный крест.
6. Войдя в храм, сотвори три поясных поклона с крестным знамением.
7. Совершай крестное знамение не спеша, не искажая крест. При крестном знамении первые три пальца руки соединяют вместе в честь Пресвятой Троицы, два пальца (безымянный и мизинец) прикладывают к ладони, что означает две природы Христа (Бог и человек). Сложив пальцы, считают их на лоб, потом на живот, потом на правое и левое плечи и только потом делают поклон. «Крест не только пальцами должен изображаться, но должно ему предшествовать сердечное расположение и полная вера».
8. В храм входят в начале богослужения: подай поминовения о здравии живых и упокоении усопших, поставь свечи, приложись к иконам. Перед целованием иконы принято положить перед ней два поясных поклона с крестным знамением, а третий после целования. Почитая икону, мы кланяемся тому, кто на ней изображен, отдавая через образ поклонения первообразу.
9. Когда проходишь мимо Царских врат (на любом расстоянии от них), остановись и сотвори поясной поклон с крестным знамением.
10. Нежелательно во время службы ходить по храму, ставить свечи, потому что это мешает общей молитве. Во время чтения Евангелия, пения Херувимской песни и Евхаристического канона следует хранить благоговейное молчание, нельзя беспокоить других вопросами и просьбами передать свечу.
11. В храме, не говорят, не отвлекаются, а вникают в богослужение, участвующих в совместной молитве. Если слова молитв и песнопений непонятны тебе, произноси про себя молитву Иисусову.
12. Наставь детей молиться, ходить в храм, вести себя в храме благочестиво.
13. В православном храме должен ты стоять. Сидеть можно только во время чтения кафизм (Псалтири) и паремий, а также болящим и крайне уставшим.
14. В храме никого не осуждают, замечания можно сделать только тому, кто явно нарушает благочиния, мешает совместной молитве. Соблюдай свет в сердце, храни молитву, помни свои грехи, молись за тех, кто грешит.
15. В Церкви в момент слушания Евангелия шашка обнажается наполовину, в знак того, что казак — воин Христов и готов защищать Веру Православную.
16. Не нужно оставлять храм до конца богослужения.
17. К Святому Причастию подходят после покаяния в грехах — исповеди и разрешительной молитвы и благословения священника (исключение делается детям до 7 лет). Готовятся к Причастию должны как минимум 3 дня соблюдать пост (воздерживаться от мясной, молочной и рыбной пищи); быть накануне на вечернем богослужении; придя домой, прочитать с Молитвослова полное правило к Причастию, которое состоит из:
-канона покаянного ко Господу Иисусу Христу;
-канона молебного ко Пресвятой Богородицы;
-канона Ангелу-хранителю;
с 12:00 ночи ничего не есть и не пить.
18. Перед Причастием руки сложены на груди крестом (сверху права), с верой и любовью ко Христу причастись Святым телом и кровью и поцелуй низ чаши. После выслушай (прочти) Благодарственные молитвы.
19. По окончании литургии прислонись к кресту, который дает верующим священник у алтаря.
20. Исходя из храма, сотвори три поясных поклона с крестным знамением.
Инициация трансляции и все-все-все
Date: 2016-05-15 11:58 am (UTC)Насчёт свободного магния - да, востпроизводимо мерять концентрацию не получается. И, кстати, магний - ещё один регулятор инициации трансляции :)
no subject
Date: 2016-05-15 02:07 pm (UTC)no subject
Date: 2016-05-15 02:47 pm (UTC)А почему тогда набор "Сделай сам мышу" 65уе, или же там надо ведрами затариваться, в переносном смысле?)
Заранее прошу простить далекого от всего , но любопытствующего)
no subject
Date: 2016-05-15 11:36 pm (UTC)С мышами самое ужасное - это не цена самой мыши, это цена отправки, карантинов и сопровождения. Если это внутри одной страны, это еще можно уложить в пару сотен долларов. Если это международное отправление - там настает песец. Любая мышь, получаемая таким серьезным заведением, как Рикен (в Японии) должна пройти тесты на все инфекции, прежде чем ее допустят внутрь заведения. Все это время она должна где-то соедржаться и кто-то должен заниматься всеми этими тестами. Вот поэтому стоимость переправки мыши и набегает 2000-5000 долларов. Еще же и на границе карантин биоматериалов, отдельно. Ну и плюс если учесть, что отправка генно-модифицированной мыши должна осуществляться в специальных контейнерах и прочая и прочая, и покупка одной мыши - это сумасшествие (если она подохнет - все зря), поэтому покупают никогда не меньше пары, а если очень важно, то две пары... в общем, сложно.
Так что там это. Как в рекламе, все самое страшное скрыто за кулисами.
no subject
Date: 2016-05-16 12:02 am (UTC)no subject
Date: 2016-05-19 07:00 pm (UTC)А насколько животный мир сложнее растительного и сколько невидимых условностей... раз в жизни попало на глаза подробностей для какой-там породы собак , а больше нигде ни о ком детально не расписано, о мышах совсем мало встречается...
Интересно всё это читать, подробности, даже если совсем не профи.